3.1.1. Tạo mẫu Bạch đàn lai trội UU89 sạch in -vitro
Tạo mẫu sạch là giai đoạn đầu tiên của quá trình nuôi cấy in-vitro và có vai trò quan trọng nhằm cung cấp nguồn vật liệu sạch cho các giai đoạn nghiên cứu tiếp theo. Yêu cầu của giai đoạn này là thu được mẫu có tỷ lệ mẫu sạch cao.
Hiện nay, phương pháp hóa học được sử dụng phổ biến để vô trùng mẫu cấy. Những hóa chất có tác dụng diệt khuẩn hay được dùng phổ biến trong nuôi cấy mô tế bào thực vật như: NaClO, Ca(OCl)2, HgCl2, H2O2, AgNO3, các chất kháng sinh…
Để các hóa chất diệt khuẩn có thể xâm nhập và bám dính tốt hơn trên bề mặt mẫu cấy, một số hóa chất có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt thường được bổ sung thêm vào các dung dịch khử trùng như: Tween 20, Tween 80,..hoặc xử lý bằng cồn 70% phối hợp với các hóa chất diệt khuẩn. Tùy loài cây mà ta lựa chọn loại hóa chất ở nồng độ và thời gian phù hợp.
Nhìn chung một loại hóa chất được lựa chọn cho quá trình vô trùng mẫu cấy phải đảm bảo 2 thuộc tính: có khả năng diệt vi sinh vật cao, không hoặc có mức độ độc tính thấp đối với mẫu cấy. Bên cạnh đó phải đảm bảo được tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ bật chồi hữu hiệu cao. Trong thí nghiệm này, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm với các công thức thí nghiệm khác nhau với HgCl2, kết quả được trình bày trong bảng 3.1 dưới đây :
Bảng 3.1. Kết quả khử trùng tạo mẫu sạch in-vitro
Hóa chất Thời gian (phút) Tỷ lệ mẫu nhiễm Tỷ lệ sạch bệnh Tỷ lệ bật chồi hữu hiệu HgCl2 0,1% 3 45.76 54.5 67.6 5 14.84 85.2 74.8 7 16.10 83.7 65.5 9 16.01 83.6 61.6 11 21.31 78.7 31.8
Kết quả nghiên cứu cho thấy thời gian khử trùng khác nhau có ảnh hưởng khác nhau về các chỉ tiêu: mẫu nhiễm, chết, mẫu sạch bệnh, mẫu bật chồi. Ở công thức khử trùng 5 phút, 7 phút, 9 phút cho tỷ lệ sạch bệnh tương đương nhau. Tuy nhiên tỷ lệ bật chồi hữu hiệu ở các công thức khử trùng lại khác nhau. Với thời gian khử trùng 5 phút cho tỷ lệ bật chồi hữu hiệu cao nhất (74,8%).
Với nồng độ HgCl2 1%, ở các công thức khử trùng cho thấy thời gian khử trùng tăng lên thì tỷ lệ mẫu nhiễm giảm; tuy nhiên tỷ lệ bật chồi hữu hiệu cũng thay đổi. Với thời gian khử trùng 3 phút, 5 phút, 7 phút và 9 phút cho tỷ lệ bật chồi hữu hiệu lần lượt là: 67,6% ; 74,6% ; 65,5% ; 61,6% ; 31,8%. Điều này cho thấy thời gian khử trùng có ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng bật chồi của mẫu. Nguyên nhân ở đây là do HgCl2 là một chất khử trùng cực độc đối với tế bào, với thời gian khử trùng dài thì khả năng ngấm của muối HgCl2 vào tế bào nhiều hơn, dẫn đến tế bào bị nhiễm độc và mất khả năng bật chồi.
Lấy tỷ lệ bật chồi hữu hiệu làm chỉ tiêu so sánh theo tiêu chuẩn Bonferoni cho thấy các công thức thí nghiệm trên có sai khác nhau có ý nghĩa.
Hình 3.1. Chồi bạch đàn lai bật chồi sau khi khử trùng
Như vậy khử trùng đoạn thân của Bạch đàn lai bằng HgCl2 0,1% với thời gian 5 phút cho tỷ lệ mẫu sạch nảy bật chồi cao nhất, đáp ứng đủ tiêu chuẩn cho các bước nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2. Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi
NAA là chất điều hòa sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm Auxin có tác dụng kích thích tạo rễ trong nuôi cấy mô thực vật. Tuy nhiên, khi bổ sung vào môi trường nhân chồi, nó có thể kích thích quá trình phát sinh hình thái chồi do tỷ lệ auxin/cytokinin trong môi trường nuôi cấy được tăng lên. Do đó để tìm ra tổ hợp giữa BAP và auxin thích hợp cho nhân nhanh chồi phải tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của BAP và NAA đến HSNC.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi CT TN BAP (mg/l) NAA (mg/l) HSNC Chất lượng chồi
ĐC 0 0 1.27 ++ CT1 0.5 0.1 4.8 ++ CT2 1 0.1 4.5 +++ CT3 0.5 0.3 6.1 +++ CT4 1 0.3 4.4 +++ CT5 0.5 0.5 5.0 +++ CT6 1 0.5 4.4 +++
Ghi chú: - Chồi không phát triển + Chồi phát triển kém
++ Chồi phát triển ở mức độ trung bình +++ Chồi phát triển tốt
Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi
Hình 3.2: Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi
Trong thí nghiệm này chỉ tiêu HSNC đóng vai trò quyết định hệ số nhân chồi càng cao thì số lượng chồi tạo ra càng nhiều .
Trong kết quả nghiên cứu này công thức thí nghiệm ĐC chỉ gồm môi trường MS không bổ sung BAP và NAA thì có HSNC đạt 1,27 và chồi kém phát triển và yếu. Trong CT1 thì có HSNC đạt khá cao là 4,8 chất lượng chồi tốt, chồi phát triển đồng đều nhưng thấp. Ở CT2 HSNC đạt 4,5 và CT3 HSNC đạt rất cao là 6,1 và chồi phát triển tốt, mập, thẳng và không phân nhánh. Khi tiếp tục thay đổi nồng độ BAP và NAA thì HSNC đã thay đổi rất nhiều. Ở CT4, CT5, CT6 thì HSNC đạt tương ứng là 4,4; 5,0 và 4,4, chồi ở các công thức này đều phát triển đồng đều nhưng phân nhiều nhánh.
Như vậy qua phân tích số liệu bảng 3.2 thì ở CT3 với nồng độ BAP 0,5mg/l và NAA 0,3mg/l là môi trường thích hợp nhất cho quá trình nhân nhanh chồi tạo nguồn vật liệu cho quá trình chuyển gen.
3.1.3. Ảnh hưởng của BAP, K và NAA đến khả năng tái sinh chồi
Theo Vuglteke (1989) môi trường nuôi cấy mô bổ sung Cytokinin có tác dụng kích thích tạo chồi. Trong đó BAP và Kinetin là những Cytokinin có hoạt tính sinh học cao nên thường được sử dụng để thúc đẩy sự phân chia tế bào và phát triển chồi của các mô nuôi cấy. Nhiều nghiên cứu trước đây của Sung và cs (2003); Gorinova (2005); Gubis và cs (2004) đều cho thấy khi phối hợp các Cytokinin như BAP và Kinetin và Zeatin với các Auxin như NAA, IBA, 2,4D thì tác động phức hợp của chúng sẽ cho tỷ lệ tạo chồi cao hơn so với khi sử dụng riêng rẽ từng chất [24].
Các lá mầm và thân mầm sau khi cắt thành những mảnh nhỏ được cấy lên các công thức môi trường tái sinh (CT1 – CT16) và được nuôi dưới dàn đèn neon. Sau 4 tuần, kết quả thu thập và xử lý số liệu trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của BAP, K và NAA đến khả năng tái sinh chồi
CT TN BAP (mg/l) K (mg/l) NAA (mg/l)
Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (%)
Chất lượng chồi ĐC 0 0 0 0 - CT 1 0.1 17.22 + CT 2 0.3 28.97 + CT 3 0.5 43.54 ++ CT 4 0.7 53.19 ++ CT 5 1 59.22 ++ CT 6 1.5 46.54 ++ CT 7 0.3 0.2 46.90 ++ CT 8 0.5 0.2 55.98 ++ CT 9 0.7 0.2 63.82 +++ CT 10 1 0.2 52.28 ++ CT 11 1.5 0.2 42.41 ++ CT 12 0.3 0.2 52.36 ++ CT 13 0.5 0.2 71.82 +++ CT 14 0.7 0.2 75.28 +++ CT 15 1 0.2 62.25 +++ CT16 1.5 0.2 48.65 +++
Ghi chú: - Chồi không phát triển + Chồi phát triển kém
++ Chồi phát triển ở mức độ trung bình +++ Chồi phát triển tốt
Hình 3.3: Ảnh hưởng của BAP, K và NAA đến khả năng tái sinh chồi
Từ bảng số liệu thu thập được ở bảng 3.2 cho thấy việc kết hợp BAP với nhóm auxin NAA vào môi trường nuôi cấy đã thể hiện rõ hiệu quả tái sinh. Ở môi trường đối chứng 100% các mẫu cấy không có khả năng tái sinh, còn trên các công thức môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BAP, K và NAA đã cho hiệu quả tái sinh chồi khá cao.
Trong các công thức nghiên cứu này thì hiệu quả tạo chồi và chất lượng chồi của các công thức là:
Từ công thức CT1 đến CT6 ta chỉ bổ sung thêm BAP vào môi trường nuôi cấy, nồng độ BAP tăng dần từ 0,1mg/l đến 1,5mg/l ta thấy tỷ lệ tái sinh chồi đã tăng lên dần từ 17,22% đến 59,22% và đạt múc cao nhất ở nồng độ 1mg/l. Nhưng khi tiếp tục tăng nồng độ BAP lên 1,5 mg/l ở CT6 thì tỷ lệ tái sinh chồi lại giảm xuống còn 46,54% và chất lượng chồi ở cả 6 CT này đều phát triển kém, không đồng đều và mảnh.
Từ CT7- CT11 ta bổ sung thêm vào môi trường BAP và 0,2mg/l K thì tỷ lệ tái sinh đã có sự biến động. Khi tăng BAP từ 0,3mg/l- 0,7mg/l thì tỷ lệ tái sinh tăng từ 46,90% đến 63,82% và đạt tỷ lệ cao nhất ở nồng độ 0,7mg/l và khi ta tiếp tục tăng nồng độ BAP lên 1mg/l và 1,5mg/l thì tỷ lệ tái sinh đã giảm xuống từ 63,82% còn 42,41%. Chất lượng chồi của các công thức này đều phát triển kém chỉ có ở CT9 thì chồi phát triển đẹp đồng đều và mập.
Từ CT12 – CT16 ta bổ sung thêm vào môi trường BAP và 0,2mg/l NAA thì tỷ lệ tái sinh đã có sự biến động rõ rệt. Khi tăng BAP từ 0,3mg/l- 0,7mg/l, tỷ lệ tái sinh tăng từ 53,36% đến 75,28% và khi tiếp tục tăng nồng độ BAP lên 1,5mg/l, tỷ lệ tái sinh đã giảm đáng kể xuống còn 48,65%. Chồi tái sinh từ công thức CT13- CT16 đều phát triển đồng đều, mập và khỏe.
Như vậy, nếu xét các tiêu chí để đánh giá khả năng tái sinh chồi là tỷ lệ mẫu tái sinh chồi và đặc điểm chồi tạo ra thì công thức CT14 là có ưu thế hơn cả. Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi đạt khá cao là 75,25% và những chồi tạo ra trên môi trường này phát triển nhanh, đồng đều, chồi mập và khỏe như vậy sẽ cung cấp nguồn vật liệu tốt cho quá trình ra rễ ở giai đoạn sau.
3.1.4. Ảnh hưởng của NAA, IBA và ABT đến khả năng ra rễ
Tạo cây ra rễ là giai đoạn cuối cùng của quá trình vi nhân giống với mục đích để tạo câu con hoàn chỉnh với yêu cầu cây khỏe mạnh, có bộ rễ cứng cáp để có thể sinh trưởng và phát triển tốt khi đưa ra ngoài vườn ươm hoặc vườn sản xuất.
Auxin là một phytohormon có tác dụng sinh lý đến quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động của tầng phát sinh, sự hình thành rễ. Ở giai đoạn này mục đích chính là tạo rễ cho chồi nên sự có mặt cũng như nồng độ phù hợp của auxin cho từng đối tượng là rất có ý nghĩa. IBA (3 - Indol Butyric Acid), IAA (Indol Acetic Acid), NAA (Napthyl Acetic Acid), ABT là những chất kích thích sinh trưởng thường được dùng trong nuôi cấy mô. Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng kết hợp hai loại chất kích thích sinh trưởng cho quá trình ra rễ của Bạch đàn. Các chồi Bạch đàn sinh trưởng, phát triển tốt có chiều cao từ 3 - 4cm được cấy chuyển sang môi trường ra rễ (R1-R4) được nuôi dưới dàn đèn neon. Sau 2 - 4 tuần nuôi thu thập và xử lý số liệu trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của NAA, IBA và ABT đến khả năng ra rễ CT TN IBA (mg/l) NAA (mg/l) ABT (mg/l) Tỷ lệ chồi ra rễ (%) Số rễ TB (rễ/cây) Chiều dài TB của rễ (cm) Chất lượng rễ ĐC 0 0 0 13.3 1 1.3 + CT1 0.5 0.5 46.7 1.9 1.7 + CT2 1 0.5 60.0 2.7 2.0 ++ CT3 1.5 0.5 73.3 3.5 2.1 +++ CT4 2 0.5 70.0 3.2 2.4 +++ CT5 0.5 0.5 36.7 1.8 1.2 + CT6 1 0.5 43.3 2.7 1.9 ++ CT7 1.5 0.5 60.0 3.3 2.1 ++
CT8 2 0.5 53.3 3.4 2.1 ++
CT9 2 1 78.1 4.9 2.8 +++
CT10 2 1 66.7 4.2 2.5 ++
Ghi chú: - Rễ không phát triển + Rễ phát triển kém
++ Rễ phát triển ở mức độ trung bình +++ Rễ phát triển tốt
Hình 3.4: Ảnh hưởng của NAA, IBA và ABT đến khả năng ra rễ
Qua số liệu bảng 3.4, ta thấy ở công thức môi trường đối chứng không có bổ sung IBA, NAA và ABT thì tỷ lệ chồi ra rễ là thấp nhất (13,3%) và rễ mảnh, ngắn và bị thâm đen. Từ CT1- CT4 và CT9 khi bổ sung thêm IBA và NAA vào môi trường thì tỷ lệ chồi ra rễ đã tăng rất rõ rệt. Ở công thức môi trường CT1- CT4 tỷ lệ ra rễ đạt được tương ứng là 46,7%; 60,0%; 73,3%; 70% số rễ/chồi là 1,9; 2,7; 3,5; 3,2 và ở CT9 khi tăng lên nồng độ 2mg/l BAP và 1mg/l NAA R2 thì tỷ lệ chồi ra rễ tăng lên rất cao đạt 735,25 và số rễ/chồi đạt là 4,9 và rễ tạo ra ở công thức này khỏe, dài, mập và trắng.
Từ CT5- CT8 và CT10 khi bổ sung thêm IBA và ABT vào môi trường thì tỷ lệ ra rễ đạt tương ứng là 36,7%; 43,3%; 60%, 53,3% và 66,7% và chất lượng rễ của các công thức này phát triển nhiều, dài và khá mập nhưng rễ bị sùi và hơi thâm đen.
Qua phân tích kết quả thu được ta thấy ở CT9 cho tỷ lệ chồi ra rễ cao nhất và số lượng, chất lượng rễ rất tốt. Ta có thể sử dụng công thức môi trường này trong việc nghiên cứu ra rễ phục vụ quá trình tái sinh cây Bạch đàn cho quy trình chuyển gen.
Lấy khuẩn lạc vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (GV3101) có chứa vector nhị thể (pGWB2) và gen mang gen EcHB1 được nuôi phục hồi để thu dịch huyền phù phục vụ cho nội dung chuyển gen.
Dịch huyền phù vi khuẩn thu được có giá trị đo OD600 = 0,5- 0,8 đủ điều kiện biến nạp vào thân và lá mầm Bạch đàn.
Đoạn thân Bạch đàn được cho vào dịch huyền phù vi khuẩn với thời gian 30 phút, sau đó được thấm khô trên giấy thấm vô trùng. Các mảnh thân được đồng nuôi cấy trong tối 48h (Diwakar Aggarwal và cs, 2011; Prakash và cs, 2009; Ho và cs, 1998) [22][37][26].
3.2.1. Ảnh hưởng của kháng sinh Kanamycin tới khả năng sống của mẫu
Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu được rửa sạch vi khuẩn bằng dung dịch 500mg/l Cefotaxime, thấm khô và cấy chuyển sang môi trường tái sinh chồi chọn lọc ở mục 3.1.2 Môi trường tái sinh này có bổ sung Kanamycin ở các nồng độ khác nhau và Cefotaxime 500mg/l (Bùi Văn Thắng và cs, 2013).
Mỗi loài cây có khả năng mẫn cảm với nồng độ Kanamycin khác nhau, vì vậy, nếu nuôi mẫu trên môi trường Kanamycin quá cao sẽ làm mẫu bị chết, hoặc bị ức chế không tái sinh. Ngược lại, nuôi trên môi trường có nồng độ kháng sinh thấp sẽ khó chọn lọc được chồi chuyển gen. Vì vậy trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành xác định ngưỡng nồng độ của kháng sinh Kanamycin để chọn lọc hiệu quả cây Bạch đàn chuyển gen.
Một số báo cáo trước đây về tái sinh và chuyển gen cây Bạch đàn, nồng độ Kanamycin được sử dụng phổ biến là ở nồng độ 50mg/l (Cheng và cs, 2006; Tounier và cs, 2003; Kawazu và cs, 2003) [18][45] và 100mg/l (Kawazu và cs, 2003; Serrano và cs, 1997) [30]. Trong nghiên cứu này chúng tôi thử nghiệm các nồng độ từ 50mg/l đến 250mg/l. Sau 4 tuần nuôi cấy kết quả được trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của Kanamycin tới khả năng sống của mẫu
CT TN Kanamycin ( mg/l) Tỷ lệ mẫu sống sau 4 tuần (%) ĐC 0 100.0 K1 50 89.5 K2 100 82.9 K3 150 68.6 K4 200 24.8
K5 250 0.0
Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của kanamycin tới khả năng sống của mẫu
Hình 3.5: Ảnh hưởng của Kanamycin tới khả năng sống của mẫu
Kết quả được trình bày ở bảng 3.5 cho thấy, Kanamycin có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng sống sót, sinh trưởng, phát triển của các chồi Bạch đàn được nuôi cấy. Ngay nồng độ 50mg/l thì tỷ lệ mẫu sống chỉ còn 89,5% sau 4 tuần nuôi cấy và tỷ lệ này là
68,6% với nồng độ 150mg/l và còn 24,8% với nồng độ 200mg/l, khi nồng độ Kanamycin 250mg/l thì 100% mẫu đều chết. Theo Nguyễn Thị Thanh Nga và cs (2012) [11], ngưỡng