Đối với cây Bạch đàn urô hoặc Bạch đàn lai thì nồng độ chất chọn lọc cho giai đoạn đầu như tái sinh chồi được chọn lọc ở nồng độ cao: 200mg/l (Laudete và cs, 2002) [32], 100mg/l (Kawasu và cs, 2003) [29]; trong khi chọn lọc ra rễ thường chỉ là 50mg/l (Cheng và cs, 2006; Tounier và cs, 2003; kawasu và cs, 2003) [18][30][45]. Vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành thử nghiệm bổ sung đánh giá khả năng ra rễ của chồi Bạch đàn ở những thang nồng độ Kanamycin khác nhau để tìm ra nồng độ Kanamycin thích hợp cho giai đoạn ra rễ tạo cây chuyển gen.
Các chồi Bạch đàn sinh trưởng, phát triển tốt có chiều cao từ 3 - 4cm được cấy chuyển sang môi trường ra rễ ở mục 3.1.4 có bổ sung thêm Cefotaxime 500mg/l và nồng độ Kanamycin khác nhau. Sau 4 tuần thu được kết quả như Bảng 3.6:
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của kanamycin tới khả năng ra rễ
CT TN Kanamycin(mg/l) Tỷ lệ ra rễ (%) Chất lượng rễ
ĐC 0 71.43 +++
C1 50 27.62 ++
C2 75 12.38 ++
C4 150 0 -
Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của Kanamycin tới khả năng ra rễ
Hình 3.6: Ảnh hưởng của Kanamycin tới khả năng ra rễ
Kết quả thu được trong bảng 3.6 cho thấy: CT TN đối chứng thì có tỷ lệ ra rễ rất cao đạt 71,43% và rễ trắng, mập và dài nhưng khi nồng độ Kanamycin bổ sung vào môi trường thì chất chọn này đã ức chế rất mạnh khả năng ra rễ. Ở công thức C1 nồng độ Kanamycin là 50mg/l thì khả năng ra rễ của Bạch đàn bị ức chế rõ rệt, tỷ lệ ra rễ đã giảm xuống chỉ còn 27,62% và rễ mảnh, ngắn và đầu rễ hơi thâm đen. Khi tiếp tục tăng nồng độ Kanamycin lên 75mg/l thì tỷ lệ ra rễ đã giảm xuống là 12,38%.
Ở môi trường bổ sung 100mg/l Kanamycin thì gần như các mẫu cấy đều bị ức chế bởi Kannamycin chỉ một vài mẫu mới ra rễ nhưng rễ rất mảnh, ngắn và thâm đen. Khi nồng độ Kanamycin tăng lên 150mg/l thì các mẫu cấy bị ức chế hoàn toàn khả năng ra rễ. Như vậy trong thí nghiệm này chúng tôi lựa chọn Kanamycin nồng độ 100mg/l là ngưỡng nồng độ thích hợp để chọn lọc cây chuyển gen ở giai đọan ra rễ cho Bạch đàn lai.
Sơ đồ: Các bước tạo cây Bạch đàn lai chuyển gen
Tóm tắt quy trình chuyển gen vào cây Bạch đàn lai trội UU89
Khử trùng HgCl2 0,1% - 5 phút
Cắt đoạn thân 0,5- 1cm Cây Bạch đàn lai trội UU89 invitro
Lây nhiễm trong 15 phút với chủng A. tumefaciens GV3101
Đồng nuôi cấy trên môi trường có AS
Rửa khuẩn, cấy lên môi trường tái sinh
MS + 0,7mg/l BAP + 0,2mg/l + 500mg/l Cefotaxim + 200mg/l Kanamycin
Cấy chuyển sang môi trường tạo rễ MS + 2mg/l IBA + 1mg/l Cây Bạch đàn UU89
Nhân nhanh chồi
3.3. Kiểm tra sự có mặt của gen EcHB1 bằng PCR
Các cây ra rễ trên môi trường ra rễ chọn lọc được thu mẫu lá để tách chiết AND tổng số và chạy phản ứng PCR kiểm tra sự có mặt của gen EcHB1 với cặp mồi đặc hiệu
EcHB1-F: 5’-CACCACGCGTGATATCATGTGCCCTATCGAT - 3’ và EcHB1-R: 5’-
GGGTCGACTTAACAAGCGGCTGAT - 3’. Kết quả thu được:
Hình 3.7: Sản phẩm kiểm tra PCR
Theo thứ tự: Đối chứng dương (plasmid), đối chứng âm (nước), cây WT (đối chứng), cây Bạch đàn trắng, DNA ladder 1 kb, TG1, TG3, TG7, TG8, TG9, TG10, TG11, TG14, TG15, TG19, TG20, TG21, TG31.
Kết quả điện di trên hình 3.5 cho thấy có 10 dòng chuyển gen (TG3, TG7, TG8, TG9, TG10, TG11, TG19, TG20, TG21, TG31) xuất hiện một băng duy nhất với kích thước khoảng 759bp tương đương với kích thước của gen EcHB1, còn dòng cây đối chứng thì không xuất hiện. Điều này chứng tỏ sự có mặt của gen EcHB1 trong 10 dòng cây Bạch đàn chuyển gen.
CHƯƠNG 4
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận
- Đề tài đã xác định các điều kiện và thành phần nuôi cấy phù hợp cho quá trình tái sinh chồi, nhân tạo chồi và ra rễ.
Tái sinh chồi: Mẫu cấy được nuôi trên môi trường: MS + 0,7mg/l BAP + 0,2mg/l NAA, tỷ lệ tái sinh chồi đạt 75,28%.
Nhân nhanh chồi: chồi tái sinh được cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh chồi: MS + 0,5mg/l BAP + 0,3mg/l NAA, HSNC đạt 6,1.
Ra rễ: Chồi được cấy trên môi trường ra rễ có thành phần: MS + 2mg/l IBA +
1mg/l NAA, tỷ lệ chồi ra rễ đạt 78,1%, 4,9 rễ/chồi. - Đã xác định các điều kiện tối ưu cho quá trình chuyển gen: Nồng độ kháng sinh
Kannamycin cho giai đoạn đầu chồi chuyển gen là 200mg/l và 100mg/l cho giai đoạn ra rễ.
- Đã xác định sự có mặt của gen EcHB1 trong cây chuyển gen (chọn lọc kháng sinh, Kỹ thuật PCR): Tiến hành chuyển gen EcHB1 vào cây Bạch đàn UU89 thu được xác định được 10 dòng Bạch đàn UU89 chuyển gen cho kết quả dương tính khi kiểm tra PCR.
4.2. Kiến nghị
- Tiếp tục đánh giá sự tồn tại và biểu hiện của gen biến nạp ở các dòng Bạch đàn lai trội UU89 chuyển gen bằng các kỹ thuật lai Southern, lai Northern, lai Western. Chuyển các dòng đã chuyển gen ra chăm sóc tại vườn ươm và đánh giá sự sinh trưởng của chúng.
- Sử dụng các kết quả đã tìm ra cho cây Bạch đàn lai UU để tạo cây Bạch đàn chuyển gen mang các gen đích có giá trị khác.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TRONG NƯỚC
1. Hà Thị Hiền (2000) Nghiên cứu nhân giống sao đen (Hopea odorata roxb) bằng phương pháp giâm hom. Luận văn thạc sỹ KH Lâm nghiệp,Trường ĐHLN.
2. Huỳnh Đức Nhân, (1996). Khảo nghiệm dòng dõi bạch đàn urô (1989- 1994).
''Kết quả nghiên cứu khoa học công nghệ lâm nghiệp 1991-1995" trang 205-208, Nhà xuất bản nông nghiệp, Hà nội 1996.
3. Lê Đình Khả và cộng tác viên, (1995). Nghiên cứu xây dựng cơ sở khoa học và công nghệ cho việc cung cấp nguồn gốc cây rừng được cải thiện. Thông tin khoa học và kinh tế lâm nghiệp số 2 – 1995.
4. Lê Đình Khả và Nguyễn Việt Cường (2001), Ưu thế lai về sinh trưởng và tính chống chịu của một số tổ hợp lai khác loài ở Bạch đàn, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 41-43.
5. Lê Đình Khả, (1970), "Một dạng Bạch đàn mới sinh trưởng nhanh ở miên Bắc Việt Nam", Tập san lâm nghiệp, (số 3), 6 trang
6. Lê Đình Khả, (1993). Trồng bạch đàn ở nước ta như thế nào cho có hiệu quả. Tạp chí lâm nghiệp, số 2, trang 9-10.
7. Lê Đình Khả, Phạm văn Tuấn, Đoàn Thị Bích, (1996). Nghiên cứu chọn giống bạch đàn. '' Kết quả nghiên cứu khoa học công nghệ lâm nghiệp 1991-1995" trang 151- 155, Nhà xuất bản nông nghiệp, Hà Nội.
8. Nguyễn Hoàng Nghĩa (2000), Chọn giống bạch đàn Eucalytus theo sinh trưởng và kháng bệnh ở Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
9. Nguyễn Quang Hà và Trần Xuân Thiệp, (1990). Có nên trồng rừng bạch đàn công nghiệp không?. Tạp chí lâm nghiệp, số 8, Trang 4-6.
10. Nguyễn Quang Thạch, (chủ biên), Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005). Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
11.Nguyễn Thị Thanh Nga, Hồ Mạnh Tường, Phạm Thị Vân, Nguyễn Tường Vân, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2012). Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào cây dưa hấu.
Tạp chí Công nghệ Sinh học 34(3): 389-396.
12.Nguyễn Việt Cường (2012). Lai giống Bạch đàn, Tràm, Keo, Thông và khảo nghiệm chọn lọc giống lai, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
13.Nguyễn Việt Cường, (2006) “Nghiên cứu lai tạo một số dòng bạch đàn, keo,tràm và thông” giai đoạn 2001 – 2005, Báo cáo tổng kết đề tài
14.Phạm Văn Tuấn, Nguyễn Hoàng Nghĩa, Lê Đình Khả, Hoàng Chương, (2000). Kết quả khảo nghiệm loài và xuất xứ bạch đàn ở Việt Nam. Tài liệu viết cho Hội nghị công nhận giống bạch đàn và keo, 17 trang.
TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI
15.Bai Jyayu, Xu Jianmin and Gan Siming (2003). Genetic improvement of Tropical Eucalypts in China. In Eucalyptus in Asia. Procedding of an international conference. Turbull J.E. edit. 64-70.
16.Carabelli, M., Morelli, G., Whitelam, G., Ruberti, I., 1996. Twilight-zone and canopy shade induction of the Athb-2 homeobox gene in green plants. Proceedings of the National Academy of Sciences 93, 3530-3535.
17.Chen Z.Z., Chang S.H., Ho C.K., Chen Y.C., Tsai J.B., Chiang V.L. (2001). Plant production of transgenic Eucalyptus camaldulensis carrying the populous tremuloides cinnamate 4-hydroxylase gene. Taiwan J. For. Sci 16: 249-258.
18.Cheng (2006). Eucalyptus urophylla transformation anf selection. Patent: US20060101535 A1.
19.Demura, T. and Ye, Z.-H. (2010) Regulation of Plant Biomass Production. Current Opin. Plant Biology. in press.
20.Demura, T., Tashiro, G., Horiguchi, G., Kishimoto,N., Kubo, M., Matsuoka, N., Minami,A., Nagata-Hiwatashi, M., Nakamura,K., Okamura, Y., Sassa, N., Suzuki,S., Yazaki,J., Kikuchi,S., and Fukuda, H. (2002) Visualization by comprehensive microarray analysis of gene expression programs during transdifferentiation of mesophyll cells into xylem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 15794-15799.
21.Di Cristina, M., Sessa, G., Dolan, L., Linstead, P., Baima, S., Ruberti, I., Morelli, G., 1996. The Arabidopsis Athb-10 (GLABRA2) is an HD-Zip protein required for regulation of root hair development. The Plant Journal 10, 393-402.
22.Diwakar Aggarwal., Anil Kumar., Sudhakara Reddy. M. (2001). Agrobacterium tumefaciens mediated genetic transformation of selected elite clone(s) of Eucalyptus tereticornis. Acta Physioll Plant. 33: 1603-1611.
23.Endo, S., Pesquet, E., Yamaguchi, M., Tashiro, G., Sato, M., Toyooka, K., Nishikubo, N., Udagawa-Motose, M., Kubo, M., Fukuda, H., and Demura, T. (2009) Identifying new components participating in the secondary cell wall formation of vessel elements in zinnia and Arabidopsis. Plant Cell, 21: 1155-1165.
24.Gubis J. Zuzana L., Jurai F., Zuzana J., (2004). Effect of growth regulators on shoot induction and plant regerenation in tomato. Biologia, Brastislava 59/3: 405-408.
25.Haake, V., Cook, D., Riechmann, J., Pineda, O., Thomashow, M. F., Zhang, J. Z., 2002. Transcription factor CBF4 is a regulator of drought adaptation in Arabidopsis. Plant Physiology 130, 639-648.
26.Ho C.K., Chang S.H., Tsay J.Y., Tsai C.J., Chiang V.L., Chen Z.Z. (1998).
Agrobacterium tumefaciens - mediated transformation of Eucalyptus camaldulensis and production of transgenic plants. Plant Cell Reports. 17: 675 - 680.
27.Johannesson, H., Wang, Y., Engström, P., 2001. DNA-binding and dimerization preferences of Arabidopsis homeodomain-leucine zipper transcription factors in vitro. Plant Molecular Biology 45, 63-73.
28.Kawaoka A., Nanto K., Ishii K., Ebinuma H. (2006). Reduction of lignin content by suppression of expression of the LIM domain transcription factor in Eucalyptus camaldulensis. Silvae Genet 55(6): 269-277.
29.Kawasu T., Keigo D. K., Keiko Kondo K. (2003). Process for transformation of mature trees of Eucalyptus plants. Patent No: US 6.563.024 B1.
30.Kawasu T., Suzuki Y ., Wada T., Kondo K., Koyama H. (2003). Over expression of a plant mitochondrial citrate synthase in Eucalyptus trees improved growth when cultured by alphosphate as a sole phosphate source. Plant Cell Physiol 44: S91
31.Kondo K., Furuyo A., Ishigi N., Kasuga M., Shinozaki K., Yamaguchi S.K, Hibino T. (2003). Analysis of the stress rresponse genes in Eucalyptus and effect of introducing several stress tolerance- giving genes in to Eucalyptus ; A development situation and a practical possibility of an environmental stress resistant tree. Plant and Animal Genome 11th, San Diego California.
32.Laudete M. S., Luis P. B. Cid, Ana C. M.B. (2002). Biolistic transformation of
Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla callus. Functional Plant Biology 29(8): 917- 924.
33.Luo Jianzhong (2003). Variation in growth and wood density of Eucalyptus urophylla. In Eucalyptus in Asia. Procedding of an international conference. Turbull J.E. edit. 94-100
34.Mullins K. V., Llewllyn D. J., Hartney V. J., Strauss S., Dennis E. S. (1997). Regeneration and transformation of Eucalyptus camaldulensis. Plant Cell Reports 16: 787-791.
35.Nguyen Duc Kien, Tran Ho Quang, Gunnar Jansson, Chris Harwood, David Clapham, Sara von Arnold (2009). Cellulose content as a selection trait in breeding for kraft pulp yield in Eucalyptus urophylla (Ann. For. Sci. (66) 711-719)
36.Poke, F.S., R.E. Vaillancourt, R.C. Elliott & J.B. Reid (2003). Sequence variation in two lignin biosynthesis genes, cinnamoyl CoA reductase (CCR) and cinnamyl alcohol dehydrogenase 2 (CAD2). Mol. Breed. 12(2): 107-118.
37.Prakash M.G., Gurumurthi K. (2009). Genetic transformation and regeneration of transgenic plant from precultured cotyledon and hypocotyl explants of Eucalyptus tereticornis Sm. Using Agrobacterium tumefaciens. In vitro Cell.Biol-Plant. 45: 429-434.
38.Ruan, J., 2013. Transcription Factor. In: Dubitzky, W., Wolkenhauer, O., Cho, K.- H.,Yokota, H. (Ed.)^(Eds.) Encyclopedia of Systems Biology. ed. Springer New York, vol. p.^pp. 2224-2224.
39.Santos, P.E.T (1990). Potential for genetic improvement program, estimates of genetic parameters and genotype x environment interaction in Eucalyptus urophylla
S.T.Blake stands. Scienctia Forestalis 43-44,11-19.
40.Schena, M., Davis, R. W., 1994. Structure of homeobox-leucine zipper genes suggests a model for the evolution of gene families. Proceedings of the National Academy of Sciences 91, 8393-8397.
41.Shao Z., Chen W., Luo H., Ye X., Zhang J. (2002). Studio on the introduction of the cecropin D gene into Eucalyptus urophylla to breed the resistant varieties to Pseudomonas solanacearum. Scientia Silvae Sinicae 38: 92-97
42.Sonoda, T., Koita, H., Nakamoto-Ohta, S., Kondo, K., Suezaki, T., Kato, T., Ishizaki, Y., Nagai,N., Iida, N., Sato, S., Umezawa, T., and Hibino, T. (2009) Increasing fiber length and growth in transgenic tobacco plants overexpressing a gene encoding the
Eucalyptus camaldulensis HD-Zip class II transcription factor. Plant Biotech. 26: 115- 120.
43.Spokevicius A.V., Beveren K.V., Leith M.A., Bossinger G. (2005).
Agrobacterium mediated in vitro transformation of wood- producing stem segments in eucalyptus. Plant Cell Reports 23: 617-624.
44.Suzuki Y., Kawasu T., Tsuyama M., Wada T., Kondo K., Mizuno R., Hara T., Koyama H. (2004). Characteristics of transgenic Eucalyptus hybrids with an over expression of a plant mitochondrial citrate synthase. Nippon Shokubutsu Seiri Gakkai nenkai oyobi Shinpojiumu Koen Yoshishu 45:07.
45.Tournier V., Grat S., Marque C., kayal W., Penchel R., Andrade D.G., Boudet A.M., Teulieres C. (2003). An efficient procedure to stably introduce genes into an economically important pulp tree (Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla). Trans Res 12: 403-411.
46.Wei, X and Borralho, N.M.G (1998a). Genetic control of growth traits of
Eucalyptus urophylla. S.T. Blake in Southest China. Silvae Genetica 47(2-3), 158-165. 47.Yamada-Watanabe K., Kawaoka A., Matsunaga K., Nanto K., Sugita K., Endo S., Ebinuma H., Murata N. (2003). Molecular breeding of Eucalyptus: analysis of salt stress tolerance in transgenic Eucalyptus camaldulensis that overexpressed choline oxidase gene (cod A). IUFRO tree biotechnology. Umea Plant Science Centre, Umea: S7-S9.
48. Zhang, H., Jin, J., Tang, L., Zhao, Y., Gu, X., Gao, G., Luo, J., 2011. PlantTFDB 2.0: update and improvement of the comprehensive plant transcription factor database. Nucleic Acids Research 39, D1114-D1117.
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) Thành phần Hàm lượng (mg/l) KNO3 1900 NH4NO3 1650 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 CaCl2 332 H3BO3 6,2 MnSO4.H2O 22,3 ZnSO4 8,6 Na2MO4 0,25 CuSO4.7H2O 0,025 CoCl2 0,025 Na2EDTA 37,3 FeSO4.7H2O 27,8 Glycin 2 Myo-inositol 100 Nicotinic acid 0,5 Thiamin.HCl 0,1
Prydoxin.HCl 0,5
Phụ lục 2: Kết quả xử lý thống kê
1.Thí nghiệm tạo mẫu in vitro
2.Thí nghiệm nhân nhanh chồi
Table Analyzed Nhan nhanhchoi
One-way analysis of variance P value P<0.0001
P value summary ***
Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 6
F 11,32
R squared 0,2454
Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 11,03 P value 0,0508
P value summary ns
Do the variances differ signif. (P < 0.05) No
ANOVA Table SS df MS
Treatment (between columns) 60,07 5 12,01 Residual (within columns) 184,7 174 1,062
Total 244,8 179
3.Thí nghiệm tái sinh
Table Analyzed Tai sinh than
One-way analysis of variance P value P<0.0001
P value summary ***
Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 16
F 32,57
R squared 0,6196
Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 35,18 P value 0,0023
P value summary **
Do the variances differ signif. (P < 0.05) Yes
ANOVA Table SS df MS
Treatment (between columns) 135,9 15 9,058 Residual (within columns) 83,43 300 0,2781 Total 219,3 315
Table Analyzed Ra re_so re
One-way analysis of variance P value P<0.0001 P value summary ***
Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 10
F 14,26
R squared 0,4331
Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 14,53 P value 0,1046
P value summary ns
Do the variances differ signif. (P < 0.05) No
ANOVA Table SS df MS
Treatment (between columns) 142,4 9 15,82 Residual (within columns) 186,3 168 1,109 Total 328,7 177
Table Analyzed Ra re_chieudai re
P value P<0.0001 P value summary ***
Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 10
F 9,927
R squared 0,3472
Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 5,428 P value 0,7956
P value summary ns
Do the variances differ signif. (P < 0.05) No
ANOVA Table SS df MS
Treatment (between columns) 29,56 9 3,284 Residual (within columns) 55,58 168 0,3308 Total 85,13 177
5.Thí nghiệm xác định nồng độ chất chọn lọc kanamycin tới khả năng sống của mẫu
Anova: Single Factor SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
Row 1 3 300 100 0
Row 3 3 248.571428 6 82.85714 3 32.65306 1 Row 4 3 205.714285 7 68.57142 9 32.65306