Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu được rửa sạch vi khuẩn bằng dung dịch 500mg/l Cefotaxime, thấm khô và cấy chuyển sang môi trường tái sinh chồi chọn lọc ở mục 3.1.2 Môi trường tái sinh này có bổ sung Kanamycin ở các nồng độ khác nhau và Cefotaxime 500mg/l (Bùi Văn Thắng và cs, 2013).
Mỗi loài cây có khả năng mẫn cảm với nồng độ Kanamycin khác nhau, vì vậy, nếu nuôi mẫu trên môi trường Kanamycin quá cao sẽ làm mẫu bị chết, hoặc bị ức chế không tái sinh. Ngược lại, nuôi trên môi trường có nồng độ kháng sinh thấp sẽ khó chọn lọc được chồi chuyển gen. Vì vậy trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành xác định ngưỡng nồng độ của kháng sinh Kanamycin để chọn lọc hiệu quả cây Bạch đàn chuyển gen.
Một số báo cáo trước đây về tái sinh và chuyển gen cây Bạch đàn, nồng độ Kanamycin được sử dụng phổ biến là ở nồng độ 50mg/l (Cheng và cs, 2006; Tounier và cs, 2003; Kawazu và cs, 2003) [18][45] và 100mg/l (Kawazu và cs, 2003; Serrano và cs, 1997) [30]. Trong nghiên cứu này chúng tôi thử nghiệm các nồng độ từ 50mg/l đến 250mg/l. Sau 4 tuần nuôi cấy kết quả được trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của Kanamycin tới khả năng sống của mẫu
CT TN Kanamycin ( mg/l) Tỷ lệ mẫu sống sau 4 tuần (%) ĐC 0 100.0 K1 50 89.5 K2 100 82.9 K3 150 68.6 K4 200 24.8
K5 250 0.0
Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của kanamycin tới khả năng sống của mẫu
Hình 3.5: Ảnh hưởng của Kanamycin tới khả năng sống của mẫu
Kết quả được trình bày ở bảng 3.5 cho thấy, Kanamycin có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng sống sót, sinh trưởng, phát triển của các chồi Bạch đàn được nuôi cấy. Ngay nồng độ 50mg/l thì tỷ lệ mẫu sống chỉ còn 89,5% sau 4 tuần nuôi cấy và tỷ lệ này là
68,6% với nồng độ 150mg/l và còn 24,8% với nồng độ 200mg/l, khi nồng độ Kanamycin 250mg/l thì 100% mẫu đều chết. Theo Nguyễn Thị Thanh Nga và cs (2012) [11], ngưỡng nồng độ chất chọn lọc phù hợp là khi nó loại bỏ được khoảng 90% các cây không chuyển gen. Căn cứ vào kết quả trên, chúng tôi lựa chọn Kanamycin 200mg/l là ngưỡng chọn lọc cho các dòng Bạch đàn chuyển gen.