Hình 15 : Mức độ tương đồng về acid amin
1.2. Vi khuẩn Acinetobacter baumannii
1.2.4.2. Tại Việt Nam
Theo tổng kết bộ Y tế năm 2004, A. baumannii cùng P. aeroginosa là những chủng vi khuẩn hàng đầu gây viêm phổi bệnh viện có khả năng kháng kháng sinh cao. Những kháng sinh sử dụng thường xuyên đã bị kháng với tỷ lệ cao như ceftriaxon 70%, ceftazidime 64%, ciprofloxacine 55% gây khó khăn cho điều trị [73].
Thống kê về viêm phổi bệnh viện năm 2012 ở khoa Hồi sức tích cực bệnh viện 115 Thành phố Hồ Chí Minh, tỉ lệ nhạy của kháng sinh imipenem và meropenem cùng là 3% [66]. Trong nghiên cứu của Nguyễn Viết Quang (2013) các chủng A. baumanni
phân lập được từ 98 bệnh nhân viêm phổi thở máy tại Khu Hồi sức sau mổ tại Bệnh viện Trung Ương Huế cho thấy vi khuẩn này kháng 17 loại kháng sinh thử nghiệm với tỷ lệ trên 50% [67]. Trong nghiên cứu của Lê Nữ Xuân Thanh và cộng sự (2017) tại hai Bệnh viện Trung Ương Huế và Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Huế, tỉ lệ các chủng vi khuẩn A. baumannii kháng carbapenem (imipenem, meropenem) là 88,3% [63].
Khảo sát về tình hình kháng thuốc của các bệnh nhân mắc viêm phổi bệnh viện và viêm phổi thở máy 2017 tại bệnh viện Chợ Rẫy cho kết quả A. baumannii là nguyên nhân chính và có sự đề kháng cao với imipenem (100%), meropenem (98%) [61]. Gần đây, nghiên cứu của Trần Diệu Linh (2018) đã phát hiện được các loại gen mã hóa cho carbapenemase ở một số vi khuẩn Gram âm tại Bệnh viện Việt Đức và
Bệnh viện Trung Ương 108 đã chỉ ra A. baumannii là vi khuẩn mang gen kháng với tỷ lệ cao nhất là 92,12 % [71].
Các nghiên cứu ở Việt Nam gần đây chỉ tập trung đánh giá về mức độ kháng kháng sinh của A. baumannii, cũng như thống kê tần suất sự có mặt của các gen mà ít để cập đến mối tương quan giữa hai yếu tố này. Vì vậy, khi thực hiện đề tài này tôi hướng tới nghiên cứu dựa trên kết quả kháng sinh đồ và tần suất xuất hiện của 4 gen mã hóa carbapenemase bao gồm OXA-23, OXA-51, VIM, IMP là những gen được quan tâm nhiều với khả năng kháng kháng sinh phổ rộng nhằm mục đích giảm thời gian chẩn đoán và điều trị cho các bệnh nhân mắc các bệnh nguy hiểm liên quan đến
A. baumannii đặc biệt là viêm phổi bệnh viện.
1.2.4.3. Các cơ chế kháng kháng sinh
Các cơ chế kháng kháng sinh của A. baumannii bao gồm: beta-lactamase, bơm đẩy thuốc, thay đổi cấu trúc aminoglycoside, thay đổi tính thấm của màng và thay thế vị trí gắn của thuốc. Các cơ chế này có thể hướng tới nhiều đích thuốc khác nhau và có thể được vận hành cùng lúc để giúp A. baumannii kháng toàn bộ các kháng sinh thuộc cùng một nhóm. Ví dụ như trong các cơ chế của A. baumannii đa kháng carbapenem, ngoài cơ chế chính thủy phân carbapenem nhờ vào sự hoạt động carbapenemase, khả năng biến đổi các PBP của cũng liên quan tính kháng carbapenem A. baumannii (Hình 5).
Beta-lactamase là một cơ chế quan trọng đối với khả năng đa kháng của A.
baumannii, đặc biệt là với các kháng sinh trong nhóm beta-lactam (Hình 5). Theo
phân loại của Ambler, có bốn phân lớp beta-lactamase đã được xác định ở vi khuẩn nói trên bao gồm: phân lớp A, B, C, D. Trong đó các gen liên quan trực tiếp hệ thống carbapenemase thuộc vào ba phân lớp A, B, D [32].
Phân lớp A: Mặc dù có khá nhiều các beta-lactamase thuộc phân lớp A được phát
hiện ở A. baumannii như TEM, SHV, CTX-M, GES, SCO, VEB, CARB và KPC tuy nhiên chúng được cho rằng chỉ đóng một vai trò nhỏ trong tính kháng beta-lactam của vi khuẩn này, đặc biệt là đối với khả năng kháng carbapenem [29,32,42].
Phân lớp B: Đây là phân lớp đóng vai trò quan trọng đối với khả năng các beta-lactam
và khả năng kháng với các chất ức chế. Mặc dù các metallo-beta lactamase không phải là các carbapenmase chiếm ưu thế ở A. baumannii, tuy nhiên VIM, IMP và SIM
các metallo-beta lactamase đã được phát hiện tham gia vào khả năng kháng ở mức độ cao với các carbapenem [29,32,42].
Phân lớp D: Các OXA beta-lactamase thường được biết đến là các penicillinase
(oxacillinase). Tuy nhiên một số OXA có khả năng thủy phân các cephalosporin phổ rộng, và đáng lo ngại hơn một số có khả năng bất hoạt carbapenem nhờ việc hoạt động như một carbapenemase. Có ít nhất 121 biến thể khác nhau của các beta- lactamase phân lớp D được phát hiện ở các cấp độ protein khác nhau, 45 trong số đó thể hiện hoạt tính thủy phân carbapenem. Các gen OXA có thể định vị trên nhiễm sắc thể hoặc một plasmid và đôi khi có thể tìm thấy trong các yếu tố di truyền chuyển vị. Hiện nay có 9 phân nhóm chính của các OXA carbapenemase đã được xác định dựa trên sự tương đồng các acid amin. Bốn phân nhóm OXA có hoạt tính của carbapenemase chiếm ưu thế ở A. baumannii bao gồm OXA-23, OXA-40/24, OXA-51
và OXA-58 [29,32,42].
Ngoài beta-lactamase bơm đẩy thuốc cũng là cơ chế liên quan đến tính kháng đối với nhiều nhóm kháng sinh khác nhau của A. baumannii như imipenem và tigecycline (Hình 5). Hiện nay có bốn nhóm bơm đẩy chính liên quan đến khả năng kháng kháng sinh của A. baumannii bao gồm siêu họ RND, siêu họ MFS, họ MATE và một họ nhỏ là SMR.
AdeABC trong họ siêu họ RND liên quan đến khả năng kháng aminoglycoside và làm
giảm nhạy cảm của A. baumannii với tigecycline [29].
Enzyme biến đổi aminoglycoside (AMEs) là cơ chế kháng chính đối với các kháng sinh aminoglycoside (Hình 5). Cơ chế này liên quan đến ba nhóm enzyme bao gồm acetyltransferases, adenyltransferases và phosphotransferases, các enzyme này có khả năng thay đổi hoặc đảo vị trí các nguyên tố trong cấu trúc hóa học của kháng sinh aminoglycoside. Các gen mã hóa cho các enzyme này có thể chuyển giữa các loại vi khuẩn khác nhau thông qua các plasmid, transposon, các yếu tố biến đổi hoặc di truyền tự nhiên [29].
Bên cạnh các cơ chế trên A. baumannii cũng được ghi nhận khả năng kháng kháng sinh với vai trò của các cơ chế khác như thay đổi tính thấm của màng và thay thế vị trí gắn thuốc.
Hình 5: Các cơ chế kháng kháng sinh của A. baumannii[8]
1.2.4.4. Tần suất xuất hiện các gen carbapenemase
Như đã trình bày ở trên, các gen carbapenamase thuộc phân lớp A chỉ đóng vai trò nhỏ trong khả năng kháng carbapenemase nên các nghiên cứu liên quan đến sự xuất hiện của các gen này còn khá hạn chế. Trong nghiên cứu của Raghdaa và cộng sự tại Ai Cập đã đề cập đến sự xuất hiện của gen GES thuộc phân lớp A với tỷ lệ xuất hiện là 50 % [45]. Một nghiên cứu cụ thể riêng với gen này tại Bỉ của Pierre và cộng sự đã cho thấy sự xuất hiện của 9 chủng A. baumannii mang GES tại 6 bệnh viện tại Bỉ chiếm 7,2 % trong số mẫu thu được [11]. Ngoài GES một số gen khác trong phân lớp này cũng nhận được sự quan tâm như TEM và KPC. Hai gen này đều là đối tượng nghiên cứu của Zhao và cộng sự trong một nghiên cứu gần đây tại khoa hồi sức tích cực của một bệnh viện tại Trung Quốc, tuy nhiên trong nghiên cứu chỉ nhận định sự có mặt của gen TEM và vắng mặt của KPC mà không đề cập cụ thể đến tỷ lệ xuất hiện [57]. Gen KPC đã xuất hiện trong nghiên cứu trong nước của Trần Diệu Linh (2018), tuy nhiên gen này chỉ được phát hiện ở E. coli và K. pneumonia
mà không được nhận diện ở các chủng A. baumannii [71].
I. Cơ chế kháng beta- lactam
A. Biến đổi PBP B. Bơm đẩy thuốc C. Quá trình thủy phân của beta-lactamase D. Biến đổi OMP II. Cơ chế kháng
aminoglycoside A. Quá trình thủy phân của AME B. Bơm đẩy thuốc C. Biến đổi vị trí gắn ribosome
IV. Cơ chế kháng colistin A. Thiết hụt LPS B. Điểm đột biến gen của pmrAB làm đột biến LPS III. Cơ chế kháng quinolon A. Đột biến DNA gyrase và topoisomerase IV B. Bơm đẩy thuốc
Phân lớp B và D là hai phân lớp được quan tâm hơn do được đánh giá là những gen chính trong cơ chế kháng carbapenem của A. baumannii. Đây cũng là các gen thường được nghiên cứu ở trong và ngoài nước, các gen phổ biến trong nhóm B metallo beta-lactamase như VIM, IMP và NDM và nhóm D là các gen thuộc họ OXA
như OXA-23, OXA-48, OXA-51, OXA-58, OXA-24. Tuy nhiên tần số xuất hiện của
các gen thuộc phân lớp B thấp hơn rất nhiều cho so với các gen thuộc phân lớp D. Các nghiên cứu tại Việt Nam cũng đã khẳng định điều này. Trong nghiên cứu của Trần Huy Hoàng và cộng sự (2016), tác giả đã điều tra sự hiện diện phân lớp B, D bao gồm NDM-1, OXA-23, OXA-24, OXA-58, IMP, VIM ở vi khuẩn A. baumannii
kháng kháng sinh phân lập từ bệnh viện bệnh nhân của ba bệnh viện lớn ở Hà Nội và phát hiện được 23/582 trường hợp (4%) dương tính với NDM-1, 550/582 trường hợp dương tính với OXA-23, 2/582 trường hợp dương tính với OXA-58 và 2/582 trường hợp dương tính với IMP. Nghiên cứu của Lê Nữ Xuân Thanh và cộng sự lại phát hiện sự có mặt của OXA-23, IMP và VIM lần lượt được tìm thấy là 85,3 %, 4,4 % và không có mẫu nào có mặt VIM [63]. Gần đây nhất là nghiên cứu của Trần Diệu Linh cũng trên 3 gen này đã đưa ra tỷ lệ OXA-23 là 92,1 % nhưng VIM không xuất hiện trong bất cứ mẫu A. baumannii phân lập nào, còn IMP chỉ xuất hiện với tần suất chưa đến 1 % [71]. Tuy nhiên, các nghiên cứu trong nước nói trên không được thực hiện tại các bệnh viện chuyên khoa về viêm phổi như Bệnh viện Phổi Trung ương và chưa thực hiện điều tra mối tương quan giữa sự xuất hiện của các gen kháng kháng sinh và khả năng kháng kháng sinh dựa trên kết quả kháng sinh đồ. Ngoài ra, các nghiên cứu trong nước trước đây chỉ tập trung sử dụng phương pháp PCR đơn mồi để phát hiện từng gen kháng kháng sinh và mất nhiều thời gian trong việc phát hiện từng gen kháng kháng sinh. Do vậy nghiên cứu này được thực hiện nhằm phát hiện đồng thời nhiều gen kháng kháng sinh bằng kỹ thuật multiplex PCR từ đó rút ngắn thời gian phát hiện các gen kháng kháng sinh liên quan, cho phép xác định phổ gen kháng kháng sinh rộng hơn nhằm hỗ trợ chẩn đoán và điều trị.
1.2.4.5. Tiêu chuẩn đánh giá mức độ kháng kháng sinh của A. baumannii
Hiện nay, có rất nhiều định nghĩa về vi khuẩn đa kháng (MDR), siêu kháng (XDR) và toàn kháng (PDR) được sử dụng trong y học để xác định các kiểu kháng khác nhau ở các vi khuẩn kháng thuốc có liên quan đến lĩnh vực chăm sóc sức khỏe. Một nhóm các chuyên gia quốc tế đã được thành lập với sự khởi đầu là Trung tâm Phòng chống và kiểm soát bệnh tật châu Âu (ECDC) và Trung tâm Phòng chống và kiểm soát bệnh tật của Mỹ (CDC) đã đưa ra các khái niệm chuẩn quốc tế nhằm mô tả đặc tính kháng của các vi khuẩn Staphylococcus aureus, Enterococcus spp,
Enterobacteriaceae (ngoại trừ Salmonella và Shigella), Pseudomonas aeruginosa và
Acinetobacter spp [33]. Các vi khuẩn trên đều là nhưng tác nhân gây bệnh đã được
chứng minh là có khả năng kháng kháng sinh mạnh.
Không có bất cứ tiêu chuẩn nào dùng để xác định các loại, lớp hoặc nhóm kháng sinh được sử dụng nhằm xác định MDR, XDR và PDR. Thông thường, để định nghĩa các khái niệm này người ta sử dụng chính phân loại các chất kháng sinh dựa trên cấu trúc hóa học. Đối với các vi khuẩn trong chi Acinetobacter, bao gồm cả A.
baumannii việc đánh giá MDR, XDR và PDR dựa theo bảng sau [33]:
Bảng 2. Tiêu chuẩn đánh giá mức độ kháng kháng sinh của A. baumannii
Nhóm kháng sinh Kháng sinh cụ thể Aminoglycoside Gentamycin Tobramycin Amikacin Netilmycin Carbapenem Imipenem Meropenem Doripenem Fluoroquinolone Ciprofloxacin Levofloxacin Nhóm phối hợp penicillin – chất ức chế beta-lactamase Piperacillin – tazobactam Ticarcillin – clavulanic acid
Cephalosporin phổ rộng Cefotaxime Ceftriaxone Ceftazidime Cefepime Kháng sinh ức chế con đường sinh tổng
hợp folate Trimethoprim - sulphamethoxazole Nhóm phối hợp penicillin – chất ức chế beta-lactamase Ampicillin – sulbactam Polymyxin Colistin Polymyxin B Tetracycline Tetracycline Doxycycline Minocycline
Tiêu chí để xác định MDR, XDR, PDR của Acinetobacter spp.
MDR: Không nhạy cảm với ≥ 1 kháng sinh cụ thể trong ≥ 3 nhóm kháng sinh.
XDR: Không nhạy cảm với ≥ 1 kháng sinh cụ thể trong tất cả các nhóm trừ 1-2 nhóm còn có tác dụng.
PDR: Không nhạy cảm với bất cứ kháng sinh nào trong danh mục trên
1.3. Các phương pháp nghiên cứu A. baumannii
1.3.1. Phương pháp nuôi cấy
Nuôi cấy vi khuẩn là phương pháp kinh điển dựa trên sự phát triển của vi khuẩn trong các môi trường thích hợp. Hầu hết các căn nguyên vi khuẩn thông thường đều có thể phát triển dễ dàng trong các môi trường rắn không chọn lọc như thạch máu, thạch chocolate. Những bệnh phẩm có tạp nhiễm nên được nuôi cấy trên các môi trường chọn lọc đặc biệt, đối với A. baumannii có thể sử dụng các môi trường như MacConkey hoặc môi trường chọn lọc Leeds Acinetobacter [8]. Sau khi nuôi cấy trên môi trường chọn lọc, hầu hết các vi khuẩn sẽ phát triển và tạo thành khuẩn lạc sau 24-48 giờ, lúc này có thể sơ bộ định hướng loại tác nhân gây bệnh. Nhuộm Gram là phương pháp định danh sơ bộ, giúp phân biệt hai nhóm vi khuẩn khác nhau dựa
trên các đặc tính sinh hóa của thành tế bào vi khuẩn, vi khuẩn Gram (-) và vi khuẩn Gram (+). Nhuộm Gram có thể sử dụng bệnh phẩm là đờm, các dịch sinh học và mẫu mô sinh thiết. Việc phân tích kết quả nhuộm Gram đòi hỏi phải có kiến thức và kinh nghiệm về hệ vi sinh vật. Một mẫu đờm với sự xuất hiện của nhiều loại vi khuẩn hình thái khác nhau phù hợp với hệ vi sinh vật ở khoang miệng bình thường. [59]. Việc xác định chính xác loại vi khuẩn gây bệnh còn phải dựa trên các hóa chất xác định tính chất sinh học, hóa học của vi khuẩn. Hiện nay trên thị trường nhiều test thử sinh hóa đã được thương mại hóa thuận tiện cho việc xác định nhiều loại vi khuẩn gây bệnh. Một trong các test sinh hóa thường được sử dụng hiện nay là các kit API của BioMérieux. Sau thời gian dài thử nghiệm các kit API đã được đánh giá là đáng tin cậy trong các nghiên cứu vi sinh. API 20E và API 20NE [76] là hai kit thử được sử dụng rộng rãi để xác định các vi khuẩn Gram (-) trong các phòng nghiên cứu vi sinh trong đó có A. baumannii. Ngoài các phương pháp định danh cổ điển, việc định danh vi sinh vật bằng dấu ấn phân tử Malditof cũng đang được ứng dụng rộng rãi trên toàn thế giới tại các viện nghiên cứu, bệnh viện và trung tâm y khoa hàng đầu hiện nay. Một ưu điểm vô cùng quan trọng của phương pháp nuôi cấy so với các phương pháp khác là sau khi phân lập và xác định chính xác vi khuẩn gây bệnh, người ta có thể tiến hành làm kháng sinh đồ để đánh giá tình trạng nhạy cảm hay đề kháng của vi khuẩn gây bệnh với các thuốc kháng sinh, từ đó sẽ hướng dẫn lựa chọn các kháng sinh thích hợp cho điều trị tối ưu. Các phương pháp xác định khả năng đề kháng của vi khuẩn thường được sử dụng như khuếch tán đĩa và E-test.
Khuếch tán đĩa dựa trên nguyên tắc đĩa tẩm kháng sinh, đặt trên môi trường thạch trước đó đã được cấy vi khuẩn thử nghiệm, lấy độ ẩm và khuếch tán kháng sinh ra bên ngoài qua môi trường thạch tạo ra gradient nồng độ kháng sinh. Nồng độ của kháng sinh ở rìa đĩa cao và giảm dần khi khoảng cách từ đĩa tăng lên đến một điểm nơi mà nó không còn ức chế cho sinh vật, sau đó sinh vật phát triển tự do. Một vùng hoặc vòng rõ ràng được hình thành xung quanh đĩa kháng sinh sau khi ủ nếu tác nhân ức chế sự phát triển của vi khuẩn [59,68].
Phương pháp E-test là một phương pháp được thiết lập tốt để thử nghiệm độ nhạy cảm của thuốc kháng khuẩn trong các phòng thí nghiệm vi
sinh trên toàn thế giới. E-test bao gồm một dải nồng độ kháng sinh được xác