2.2.4.6 Điện di
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2-3% đã bổ sung thuốc nhuộm Redsafe. Thuốc nhuộm RedSafe được bổ sung theo tỉ lệ 1 µl/ 20 ml gel agarose 2- 3%. 5 µl sản phẩm PCR và 3 µl thang chuẩn 100 bp (Thermo Scientific, Mỹ) sẽ được điện di trong đệm TAE 1X (Tris base 0,04 M, acid acetic 0,02 M và EDTA 1 mM).
Quá trình điện di kéo dài trong khoảng 45 phút ở 100 V. Sản phẩm PCR sau điện di được quan sát bằng UV và được chụp lại bằng hệ thống Gel Doc (Bio-Rad, Mỹ).
2.2.5. Phân tích kết quả
2.2.5.1. Phân tích trình tự DNA
Một số sản phẩm PCR cần quan tâm được gửi đi giải trình tự. Sản phẩm PCR chứa các đoạn gen đích không cần tinh sạch (do có nồng độ cao (>20ng/l)) được đem đi giải trình tự tại công ty Macrogen (Hàn Quốc) [75], sử dụng phương pháp giải trình tự Sanger . Kết quả giải trình tự sẽ được phân tích bằng phần mềm Snap Gene để tìm vị trí bắt cặp mồi đặc hiệu trên kết quả giải trình tự, từ đó đoạn trình tự đích sẽ được so sánh với trình tự tham chiếu trên ngân hàng gene NCBI. Sau khi xác định được trình tự phù hợp với gen tham chiếu, tiếp tục sử dụng các công cụ, phần mềm hỗ trợ cho việc xử lí kết quả về trình tự gen như BLAST 2.9.0, CLUSTALW, MEGA 7 nhằm xác định mức độ tương đồng giữa trình tự gen kiểm tra so với các trình tự khác trên thế giới.
Trình tự DNA được dịch sang trình tự protein bằng phần mềm CLUSTALW. Phần mềm MEGA 7 được sử dụng để xác định mức độ tương đồng giữa trình tự protein thu được với các trình tự khác trên thế giới.
2.2.5.2. Xử lý số liệu
Excel 2016 được sử dụng để phân tích và thống kê các số liệu liên quan đến tần suất xuất hiện các gen và so sánh tỷ lệ tương đồng của trình tự DNA và protein của các mẫu thử nghiệm.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tần suất có mặt của các gen kháng kháng sinh trong hệ gen A. baumannii phân lập tại Bệnh viện Phổi Trung ương
3.1.1 Tần suất xuất hiện các gen đơn
Kết quả thống kê dựa trên xác định đồng thời sự có mặt của 4 gen đích bao gồm: OXA-23, OXA-51, VIM và IMP trong 100 mẫu DNA tinh sạch từ các mẫu bệnh phẩm dương tính với A. baumannii thu tại Bệnh viện Phổi Trung ương.
Quy trình PCR đã được tối ưu hóa các thành phần tham gia phản ứng cho phép khuếch đại đặc hiệu cả bốn gen đích thể hiện rõ bằng hình ảnh 4 băng rõ nét ở đúng các vị trí mong muốn với kích thước dự kiến trong mẫu mang cả 4 gen (Hình 8).