2. Mục tiêu của đề tài
2.2.3.Phương pháp tách ADN
2.2.3.1. Tách metagenomic ADN từ các mẫu ruột
Mẫu ruột được tách bằng ba phương pháp khác nhau nhằm tối ưu hóa quá trình tách ADN phục vụ giải trình tự metagenome trên các hệ máy giải trình tự thế hệ mới.
Phương pháp 1: Sử dụng Phenol : Chloroform : Isoamyl Alcohol Quy trình thực hiện:
- Dùng dao tách 200 mg - 300 mg phần ruột tôm chuyển sang ống Eppendorf. - Hòa tan mẫu trong dung dịch đệm tách chiết (Extract Buffer) với tỉ lệ 100 mg
mô/1,2 ml dung dịch đệm.Thành phần dung dịch đệm như sau: o 100 mM KCl
o 10 mM Tris-HCl, pH = 8 o 25 mM EDTA, pH = 8 o 0,5 % SDS
- Thêm Lysozyme đến nồng độ cuối cùng là 10 mg/ml, sau đó ủ mẫu ở 25oC trong khoảng 2 giờ.
- Sau khi lấy mẫu ra khỏi bể ổn nhiệt thêm 1 ml NaCl 6M vào hỗn hợp dung dịch, giữ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó đem ly tâm ở 14000 v/p trong 15 phút ở 4oC. Chuyến dịch phía trên sang ống Eppendorf mới.
- Thêm vào dung dịch mẫu một lượng tương đương về thể tích hỗn hợp dung dịch Phenol: Chloroform : Isoamyl alcohol (25: 24 :1), lắc mạnh, sau đó ly tâm ở 14000 v/p trong 15 phút ở 4oC. Hút dịch pha trên (pha nước có chứa ADN tổng số) chuyển sang ống Eppendorf mới.
- Tiếp tục thêm vào dung dịch một lượng tương đương về thể tích dung dịch Chloroform : Isoamyl Alcohol (24 :1), lắc mạnh, sau đó ly tâm ở 14000 v/p trong 15 phút ở 4oC. Hút dịch pha trên (pha nước có chứa ADN tổng số) chuyển sang ống Eppendorf mới.
- Tủa ADN bằng Ethanol 100% (cồn tuyệt đối). Bổ sung cồn tuyệt đối với tỉ lệ thể tích cồn: mẫu (2:1). Ủ ở -20oC qua đêm. Ly tâm 14000 v/p trong 15 phút ở 4oC. Loại bỏ dịch, thu lấy tủa.
- Rửa tủa bằng cồn 70%. Ly tâm 14000 v/p trong 15 phút ở 4oC. Loại bỏ dịch, thu lấy tủa.
- Làm khô tủa ADN bằng máy SpeedVac trong 5 phút. Sau đó hòa tan lại tủa trong 100 µl H2O tinh sạch. Bảo quản ADN ở -20oC. Kiểm tra ADN bằng điện di trên gel agarose 0,8 %.
Phương pháp 2: Sử dụng Kit PowerSoil® DNA Isolation
- Dùng dao tách 200 mg - 300 mg phần ruột tôm chuyển sang ống PowerBead - Lắc hoặc vortex để trộn đều mẫu.
- Kiểm tra dung dịch C1. Nếu C1 bị kết tủa, ủ ở 60C cho đến khi tan trước khi sử dụng.
- Thêm 60 l dung dịch C1 và đảo ngược nhiều lần hoặc lắc thời gian ngắn. - Vortex 5-10 phút ở tốc độ tối đa.
- Ly tâm 10.000 x g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng.
- Chuyển dịch nổi sang ống 2 ml với thể tích mong muốn khoảng 400-500 µl. - Thêm 250 l đệm C2 và lắc trong 5 giây. Ủ ở 4 C trong 5 phút.
- Ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút 10.000 x g.
- Chuyển dịch nổi sang ống 2 ml nhưng không vượt quá 600 l.
- Thêm 200 l đệm C3 và vortex một thời gian ngắn. Ủ ở 4 C trong 5 phút. - Ly tâm các ống ở nhiệt độ phòng trong 1 phút 10.000 x g.
- Chuyển dich nổi vào ống 2 ml không vượt quá 750 l.
- Lắc để trộn đệm C4 trước khi sử dụng. Thêm 1200 l đệm C4, lắc hoặc vortex 5 trong giây.
- Chuyển lần lượt 675 l lên cột tách và ly tâm tại 10.000 x g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng, loại bỏ dịch chảy qua cột và lặp lại cho đến hết dung dịch ở mỗi mẫu.
- Thêm 500 l đệm C5 ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút tại 10.000 x g.
- Loại bỏ các phần dung dịch qua qua cột.
- Ly tâm một lần nữa ở nhiệt độ phòng trong 1 phút tại 10.000 x g.
- Chuyển cột tách sang ống 2 ml sạch. - Thêm 100 l đệm C6.
- Ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút tại 10.000 x g.
ADN sau khi tách thành công được tiến hành do nồng độ và độ tinh sach bằng máy Nanodrop, kiểm tra bằng điện di trên agarose 1% và bảo quản ở -20oC. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phương pháp 3: Kết hợp giữa phương pháp tách tay và sử dụng bộ Kit thương mại
- Dùng dao tách 200 mg - 300 mg phần ruột tôm chuyển sang ống Eppendorf sạch.
- Dẫn dung dịch PBS 1X vào mỗi ống tới 2 ml.
- Ly tâm 700 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ cặn lắng. Dùng pipet nhẹ nhàng hút phần dịch sang ống eppendorf mới. Lặp lại 1-2 lần cho tới khi không thấy cặn tủa.
- Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch, thu tủa.
- Kiểm tra dung dịch C1. Nếu C1 bị kết tủa, ủ ở 60C cho đến khi tan trước khi sử dụng.
- Thêm 60 l dung dịch C1 và đảo ngược nhiều lần hoặc lắc thời gian ngắn. - Vortex 5-10 phút ở tốc độ tối đa.
- Ly tâm 10.000 x g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng.
- Chuyển dịch nổi sang ống 2 ml với thể tích mong muốn khoảng 400-500 µl. - Thêm 250 l đệm C2 và lắc trong 5 giây. Ủ ở 4 C trong 5 phút.
- Ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút 10.000 x g.
- Chuyển dịch nổi sang ống 2 ml nhưng không vượt quá 600 l .
- Thêm 200 l đệm C3 và vortex một thời gian ngắn. Ủ ở 4 C trong 5 phút. - Ly tâm các ống ở nhiệt độ phòng trong 1 phút 10.000 x g.
- Chuyển dich nổi vào ống 2 ml không vượt quá 750 l .
- Lắc để trộn đệm C4 trước khi sử dụng. Thêm 1200 l đệm C4, lắc hoặc vortex 5 trong giây.
- Chuyển lần lượt 675 l lên cột tách và ly tâm tại 10.000 x g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng, loại bỏ dịch chảy qua cột và lặp lại cho đến hết dung dịch ở mỗi mẫu.
- Thêm 500 l đệm C5 ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút tại 10.000 x g.
- Loại bỏ các phần dung dịch qua qua cột.
- Ly tâm một lần nữa ở nhiệt độ phòng trong 1 phút tại 10.000 x g.
- Chuyển cột tách sang ống 2 ml sạch. - Thêm 100 l đệm C6.
ADN sau khi tách thành công được tiến hành do nồng độ và độ tinh sach bằng máy Nanodrop, kiểm tra bằng điện di trên agarose 1% và bảo quản ở -20oC.
2.2.3.2. Tách metagenomic ADN từ các mẫu nước
Các mẫu nước lọc qua lưới lọc có kích thước 45 µm để loại bỏ tảo cũng như các chất lơ lửng và được bảo quản lạnh trong quá trình vận chuyển về phòng thí nghiệm để tiến hành lọc thu sinh khối tế bào vi khuẩn theo mô tả của Yuyi và cộng sự., 2014.
Hình 2.1. Hình ảnh quá trình lọc nước qua các màng lọc có kích thước 8 µm, 0,8
µm và 0,22 µm.
Mẫu nước được lọc lần lượt qua màng 8 µm và 0,8 µm (Whatman) bằng bơm hút chân không và giữ lại phần nước dưới bình lọc. Phần nước sau khi được lọc qua màng 0,8 µm tiếp tục được lọc qua màng 0,22 µm (Corning), sau khi lọc qua màng 0,22 µm phần màng lọc được dùng để tách ADN theo ba phương pháp khác nhau (Hình 2.2).
Phương pháp 1: Sử dụng bộ Powersoil MOBIO (MO-BIO)
- Chuẩn bị mẫu: Cân 250 mg màng lọc khuẩn, bổ sung vào ống có chứa dung dịch PowerBead, vortex để trộn đều mẫu. Sau đó bổ sung thêm 60 µl dung dịch C1, trộn đều mẫu bằng cách đảo ngược ống hoặc vortex. Siết chặt nắp ống và vortex mạnh
mẫu trong 5-10 phút. Sau khi vortex, ly tâm ống mẫu với tốc độ 10.000g/phút trong 30 giây ở nhiệt độ phòng.
- Ly giải tế bào: Hút khoảng 400 – 500 µl dịch nổi phía trên ống mẫu sau khi ly tâm, chuyển sang ống eppendorf 2ml mới và bổ sung thêm vào mỗi ống mẫu 250 µl dung dịch C2, vortex trong 5 giây và ủ mẫu ở 4oC trong 5 giây. Ly tâm ống mẫu với vận tốc 10.000 vòng/phút trong 1 phút ở nhiệt độ phòng.
- Loại bỏ các chất ức chế: Hút 600 µl dịch nổi phía trên ống sau khi ly tâm, chuyển sang ống eppendorf 2ml mới, bổ sung 200 µl dung dịch C3, vortex trong 5 giây, ủ mẫu ở 4o trong 5 phút. Ly tâm mẫu với vận tốc 10.000 vòng/phút trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Gắn kết ADN: Hút 600 µl dịch nổi phía trên, chuyển sang ống eppendorf 2ml mới. Sau đó bổ sung 1200 µl thêm dung dịch C4, vortex đều trong 5 giây, ủ mẫu ở 4oC trong 5 phút. Chuyển 600 µl dung dịch sang cột ly tâm, ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 1 phút ở nhiệt độ phòng, loại bỏ dịch ở đáy ống ly tâm. Lặp lại bước này 3 lần. - Rửa ADN: Bổ sung 500 µl dung dịch C5 vào cột ly tâm, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút ở nhiệt độ phòng.
- Thôi ADN: Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 2ml mới, bổ sung vào giữa cột lọc 100 µl dung dịch C6, ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 1 phút. Sau đó loại bỏ cột lọc.
Phương pháp 2: Sử dụng bộ kit DNA Stool Mini Kit (QIAgen) các bước tiến hành
bao gồm:
- Chuẩn bị mẫu: Cân từ 180-220 mg mẫu, cho mẫu vào ống eppendorf 2 ml.
- Bổ sung 1,4 ml dung dịch ASL vào mỗi ống mẫu. Vortex mẫu liên tục trong 1 phút. - Ủ ống mẫu trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 70oC trong 5 phút.
- Vortex ống mẫu trong 15 giây và ly tâm ống mẫu ở tốc độ 20.000 x g trong 1 phút. - Hút 1,2 ml dịch nổi phía trên ống và chuyển sang ống eppendorf 2 ml mới. Loại bỏ cặn dưới đáy ống.
- Bổ sung vào mỗi ống mẫu 1 viên InhibitEX, vortex ngay lập tức và liên tục trong 1 phút cho đến khi viên InhibitEX tan hoàn toàn. Ủ ống mẫu trong 1 phút ở nhiệt độ phòng để các chất ức chế bị hấp thu vào viên InhibitEX.
- Ly tâm ống mẫu ở tốc độ cao trong 3 phút để thu dịch nổi phía trên, hút toàn bộ dịch nổi cho sang ống eppendorf 1,5 ml mới, loại bỏ cặn lắng. Tiếp tục ly tâm ống mẫu ở tốc độ cao trong vòng 3 phút.
- Hút 200 µl dịch nổi phía trên sang ống eppendorf mới có bổ sung 15 µl Proteinase K.
- Bổ sung vào ống mẫu 200 µl dung dịch AL, vortex trong 15 giây. - Ủ ống mẫu ở 70oC trong 10 phút.
- Bổ sung 200 µl ethanol (96-100%) vào ống mẫu, vortex trong thời gian ngắn. - Chuyển toàn bộ dung dịch trong ống sang cột QIAamp và ống ly tâm mới, ly tâm ở tốc độ cao trong vòng 1 phút. Loại bỏ dịch dưới đáy ống ly tâm.
- Bổ sung vào cột QIAamp 500 µl Buffer AW1, ly tâm ở tốc độ cao trong vòng 1 phút.
- Tiếp tục bổ sung 500 µl Buffer AW2 vào cột QIAamp, ly tâm ở tốc độ cao trong vòng 3 phút để loại hoàn toàn dịch bám ở màng lọc.
- Chuyển cột QIAamp sang ống eppendorf 2 ml mới. Bổ sung 100-200 µl Buffer AE vào chính giữa cột, ly tâm ở tốc độ cao trong vòng 1 phút để thôi ADN ra khỏi màng lọc.
Phương pháp 3: Sử dụng các hóa chất và protocol theo mô tả bởi Yu và cộng sự năm
2004, các bước tiến hành gồm:
- Chuyển 0,25 g mẫu màng lọc sang ống 2 ml. Bổ sung 1 ml Lysis buffer (500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM EDTA, and 4% SDS) và 0.4 g hạt bead zirconia beads (0.5 mm).
- Vortex ống mẫu ở tốc độ cao nhất trong 3 phút.
- Ủ ống mẫu ở 70oC trong 15 phút, đảo nhẹ ống mẫu mỗi 5 phút/lần.
- Ly tâm ống mẫu ở tốc độ 16.000 xg ở nhiệt độ 4oC trong 5 phút. Chuyển dịch nổi sang ống 2 ml mới.
- Bổ sung 300 µl lysis buffer vào ống mẫu, lặp lại từ bước 2 tới bước 4, sau đó gộp dịch nổi ở các ống sang ống 2 ml mới.
- Bổ sung 260 µl ammoni axetat 10 M vào mỗi ống, trộn đều và ủ 5 phút trên đá. Ly tâm ống mẫu ở 4oC trong 10 phút với tốc độ 16.000 xg.
- Chuyển dịch nổi sang ống 2 eppendorf 1,5 ml mới, bổ sung 1 thể tích Iso-propanol và trộn đều, ủ ống mẫu trong đá 30 phút.
- Ly tâm ở 4oC trong vòng 15 phút ở tốc độ 16.000 vòng/phút, loại bỏ dịch nổi, rửa kết tủa bằng etanol 60%, để khô tủa tự nhiên trong điều kiện phòng.
- Hòa tan tủa trong 100 µl TE buffer và gộp các ống mẫu lại với nhau. - Bổ sung 2 µl RNase (10 mg/ml), ủ ở 37oC trong 15 phút.
- Bổ sung 15 µl Proteinase K và 200 µl Buffer AL (trong bộ kit QIAamp DNA Stool Mini Kit), trộn đều, và ủ trong bể ổn nhiệt ở nhiệt đô 70oC trong 10 phút.
- Bổ sung 200 µl Ethanol, trộn đều và chuyển hỗn hợp dung dịch sang cột QIAamp, ly tâm 16.000 xg trong 1 phút.
- Bỏ dịch dưới đáy cột, bổ sung 500 µl AW1 buffer (QIAgen), ly tâm 1 phút ở nhiệt độ phòng.
- Bỏ dịch dưới đáy cột, bổ sung 500 µl AW2 buffer (QIAgen), tiếp tục ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Làm khô cột bằng cách ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút.
- Chuyển cột sang ống 1,5 ml mới. Ly tâm trong 1 phút ở nhiệt độ phòng, thu ADN.