Kết quả tách ADN mẫu nước

Chương 3 Kết quả và thảo luận

3.2. Kết quả tách ADN tổng số của các mẫu ruột, nước

3.2.2. Kết quả tách ADN mẫu nước

Sử dụng 3 phương pháp tách chiết ADN như đã mô tả trong phần phương pháp, chúng tôi đã thu được các kết quả tách ADN tổng số của các mẫu nước được trình bày trên hình 3.4 và bảng 3.4.Về nguyên tắc, hai phương pháp tách dùng kit của MOBIO và QIAgen đều sử dụng cột ly tâm, cho phép ADN với màng silica trong cột bằng liên kết ion. Còn phương pháp của Yu và cộng sự năm 2004 thì sử dụng muối

nồng độ cao để tủa ADN, sau đó tủa ADN được tinh sạch một lần nữa qua cột silica trong bộ kit của QIAgen.

Bảng 3.4. Kết quả định lượng ADN tổng số tách chiết theo ba phương pháp

Phương pháp

Mẫu Nồng độ (ng/µl)

Độ tinh sạch (A260/280) Phương pháp 1 ST1 29,9 1,8 Phương pháp 1 ST2 27,8 1,81 Phương pháp 2 ST1 48,0 1,85 Phương pháp 2 ST2 45,9 1,9 Phương pháp 3 ST1 107,8 2,0 Phương pháp 3 ST2 91,0 1,98

Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy, phương pháp sử dụng hóa chất theo mô tả của Yu và cộng sự (2004) (phương pháp 3) cho nồng độ ADN cao nhất ở cả 2 mẫu nước ao tôm bệnh và nước ao tôm không bệnh. Tuy nhiên, hình ảnh điện di hình 2.3 cho thấy metagenomic ADN tách theo phương pháp này bị đứt gãy rất cao với hình ảnh vệt sáng kéo dài, do đó dẫn đến máy Nanodrop tính toán cả các đoạn đứt gãy này thành nồng độ tổng số của ADN.

Kết quả ở hình 3.4 cho thấy, ở cả 2 phương pháp tách chiết sử dụng bộ kit của MOBIO và QIAGEN đều thu được các băng metagenomic ADN có kích thước lớn, băng sáng gọn, ít bị đứt gãy. Trong khi đó phương pháp tách sử dụng hóa chất theo mô tả của Yu (2004) thì các băng ADN thu được đều bị đứt gãy ở cả 2 mẫu màng lọc nước.

Hình 3.4. Sản phẩm tách chiết ADN tổng số từ mẫu ruột tôm

sử dụng ba phương pháp khác nhau

A: Phương pháp 1, B: Phương pháp 2, C: Phương pháp 3; M: Marker 1 kb (Thermo Scientific)

Với hai phương pháp tách sử dụng bộ kit của QIAgen, và bộ kit MOBIO, độ tinh sạch của metagenomic ADN đều nằm trong khoảng cho phép (A260/280 từ 1,8 – 2). Nồng độ metagenomic ADN ở 2 mẫu nước ao tôm không bệnh và nước ao tôm bệnh lần lượt là 48 ng/µl và 45,9 ng/µl. Trong khi đó các mẫu tách theo phương pháp sử dụng bộ kit MOBIO có nồng độ lần lượt là 29,9 ng/µl và 27,8 ng/µl. Cả hai bộ kit này đều sử dụng công nghệ loại bỏ axit humic, một hợp chất tồn tại phổ biến trong môi trường và gây ức chế phản ứng PCR. Bộ kit MOBIO là công nghệ Inhibitor Removal (trong dung dịch Solution 3); bộ kit QIAgen là công nghệ InhibitEX. Do vậy, chất lượng của metagenomic ADN tách theo hai phương pháp này đều đạt cho giải trình tự gen thế hệ mới.

Do nồng độ metagenomic ADN tách theo bộ kit của QIAgen cao hơn so với nồng độ ADN tách theo bộ kit MOBIO, vì vậy chúng tôi lựa chọn bộ kit này cho việc tối ưu phương pháp cũng như sử dụng để tách ADN với các mẫu tiếp theo.

Để tăng hiệu suất tách metagenomic ADN, chúng tôi tăng nhiệt độ ủ mẫu ở bước 3 của quá trình tách chiết lên 95oC. Nhiệt độ này giúp cho quá trình ly giải thành tế bào của các vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn gram dương được dễ dàng hơn (https://www.qiagen.com). Kết quả định lượng ADN bằng máy đo Nanodrop cho thấy, nồng độ trung bình của metagenomic ADN khi ly giải ở 95^oC là 50 ng/µl cao hơn so với mẫu ly giải ở nhiệt độ 70oC (45,9 ng/µl) (Hình 3.5).

Hình 3.5. Hình ảnh điện đi metagenomic ADN của mẫu với nhiệt độ ly giải 95 và

70 độ; M: Marker 1kb (Thermo Scientific); ST95: Mẫu tách với nhiệt độ ly giải 95oC; ST70: Mẫu tách với nhiệt độ ly giải 70oC

Như vậy có thể khẳng định việc sử dụng tỏ nhiệt độ cao (95oC) đã tăng sự ly giải tế bào vi khuẩn thuộc nhóm Gram dương, dẫn đến nồng độ ADN thu được cũng tăng theo.

Từ những kết quả trên, chúng tôi đã xây dựng được một quy trình tách metagenomic ADN từ mẫu nước sử dụng bộ kit QIAgen stool mini kit gồm các bước cụ thể sau (Hình 3.6):

+ Chuẩn bị mẫu

- Lọc mẫu nước lần lượt qua màng 8 µm và 0,8 µm (Whatman) bằng bơm hút chân không và giữ lại phần nước dưới bình lọc. Phần nước sau khi được lọc qua màng 0,8

µm tiếp tục được lọc qua màng 0,22 µm (Corning), sau khi lọc qua màng 0,22 µm phần màng lọc được dùng để tách ADN.

- Cân từ 180-220 mg màng lọc, cắt nhỏ màng và cho vào ống eppendorf 2 ml.

+ Tách metagenomic ADN

- Bổ sung 1,4 ml dung dịch ASL vào mỗi ống mẫu. Vortex mẫu liên tục trong 1 phút. - Ủ ống mẫu trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 70oC trong 5 phút.

- Vortex ống mẫu trong 15 giây và ly tâm ống mẫu ở tốc độ 20.000 xg trong 1 phút. - Hút 1,2 ml dịch nổi phía trên ống và chuyển sang ống eppendorf 2 ml mới. Loại bỏ cặn dưới đáy ống.

- Bổ sung vào mỗi ống mẫu 1 viên InhibitEX, vortex ngay lập tức và liên tục trong 1 phút cho đến khi viên InhibitEX tan hoàn toàn. Ủ ống mẫu trong 1 phút ở nhiệt độ phòng để các chất ức chế bị hấp thu vào viên InhibitEX.

- Ly tâm ống mẫu ở tốc độ cao trong 3 phút để thu dịch nổi phía trên, hút toàn bộ dịch nổi cho sang ống eppendorf 1,5 ml mới, loại bỏ cặn lắng. Tiếp tục ly tâm ống mẫu ở tốc độ cao trong vòng 3 phút.

- Hút 200 µl dịch nổi phía trên sang ống eppendorf mới có bổ sung 15 µl Proteinase K.

- Bổ sung vào ống mẫu 200 µl dung dịch AL, vortex trong 15 giây. - Ủ ống mẫu ở 95^oC trong 10 phút.

- Bổ sung 200 µl ethanol (96-100%) vào ống mẫu, vortex trong thời gian ngắn. - Chuyển toàn bộ dung dịch trong ống sang cột QIAamp và ống ly tâm mới, ly tâm ở tốc độ cao trong vòng 1 phút. Loại bỏ dịch dưới đáy ống ly tâm.

- Bổ sung vào cột QIAamp 500 µl Buffer AW1, ly tâm ở tốc độ cao trong vòng 1 phút.

-Tiếp tục bổ sung 500 µl Buffer AW2 vào cột QIAamp, ly tâm ở tốc độ cao trong vòng 3 phút để loại hoàn toàn dịch bám ở màng lọc.

- Chuyển cột QIAamp sang ống eppendorf 2 ml mới. Bổ sung 100-200 µl Buffer AE vào chính giữa cột, ly tâm ở tốc độ cao trong vòng 1 phút để thôi ADN ra khỏi màng lọc.

Hình 3.6. Sơ đồ quy trình tách chiết metagenome ADN từ mẫu nước phục vụ giải

trình tự gen thế hệ mới