Kết quả tách ADN mẫu ruột

Chương 3 Kết quả và thảo luận

3.2.1.Kết quả tách ADN mẫu ruột

3.2. Kết quả tách ADN tổng số của các mẫu ruột, nước

3.2.1.Kết quả tách ADN mẫu ruột

Sử dụng ba phương pháp tách ADN từ mẫu ruột như đã mô tả ở phần phương pháp, chúng tôi thu được các kết quả như hình 3.2 và bảng 3.3.Từ kết quả thu được như trên bảng 3.3 và hình 3.2, có thể thấy lượng ADN tổng số thu được bằng phương pháp 1 là lớn nhất ở cả hai mẫu ruột tôm không bệnh và bị bệnh, lần lượt là 62,5 ng/µl và 80,9 ng/µl, tuy nhiên, sản phẩm tách bị lẫn nhiều tạp chất (A260/280 chỉ đạt 1,61 và 1,72 lần lượt ở hai mẫu)và xuất hiện dải smear cho thấy ADN bị đứt gãy khá nhiều (Hình 3.4A). Kết quả trên Hình 3.4B và 3.4C thể hiện chất lượng của ADN tách được bằng hai phương pháp 2 và 3 được cải thiện hơn rất nhiều so với phương pháp 1 về độ tinh sạch và chất lượng ADN tổng số ở cả hai mẫu. Cụ thể, không nhận thấy (hình 3.4C) hoặc nhận thấy rất ít (hình 3.4B) dải smear của ADN tổng số, cho thấy ADN tổng số không bị đứt gãy nhiều trong quá trình tách chiết. Bên cạnh đó, mặc dù ADN của hai mẫu ruột thu nhận được từ hai phương pháp có độ tinh sạch khá cao (A260/280 lần lượt là 1,86 và 1,90, 1,87 và 1,92), nhưng nồng độ ADN của hai mẫu ruột thu được từ phương pháp 2 thấp hơn nhiều (lần lượt là 22,3 ng/µl và 34,2 ng/µl) so với

thu được từ phương pháp 3 (lần lượt là 50,4 ng/µl và 56,7 ng/µl). Như vậy, có thể khẳng định thực hiện phương pháp 3 (kết hợp giữa phương pháp tách bằng tay và sử dụng bộ kit thương mại) có thể thu nhận được metagenome ADN có chất lượng tốt phục vụ giải trình tự metagenome ADN thu được từ mẫu nước bằng máy giải trình tự thế hệ mới.

Bảng 3.3. Kết quả định lượng ADN tổng số tách chiết theo ba phương pháp

Phương pháp Mẫu Nồng độ OD (A260/280)

Phương pháp 1 ST1 62,5 1,61 Phương pháp 1 ST2 80,9 1,72 Phương pháp 2 ST1 22,3 1,86 Phương pháp 2 ST2 34,2 1,90 Phương pháp 3 ST1 50,4 1,87 Phương pháp 3 ST2 56,7 1,92

Hình 3.2. Sản phẩm tách chiết ADN tổng số từ mẫu ruột tôm

sử dụng ba phương pháp khác nhau

A: Phương pháp 1, B: Phương pháp 2, C: Phương pháp 3; M: Marker 1 kb (Thermo Scientific)

Như vậy, chúng tôi đã tối ưu quy trình tách metagenome ADN từ mẫu ruột tôm thẻ kết hợp giữa phương pháp tách tay và sử dụng bộ kit PowerSoil® DNA Isolation gồm các bước cụ thể như sau (Hình 3.3):

- Dùng dao tách 200 mg - 300 mg phần ruột tôm chuyển sang ống Eppendorf sạch.

- Dẫn dung dịch PBS 1X vào mỗi ống tới 2 ml.

- Ly tâm 700 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ cặn lắng. Dùng pipet nhẹ nhàng hút phần dịch sang ống eppendorf mới. Lặp lại 1-2 lần cho tới khi không thấy cặn tủa.

- Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch, thu tủa.

- Kiểm tra dung dịch C1. Nếu C1 bị kết tủa, ủ ở 60C cho đến khi tan trước khi sử dụng.

- Thêm 60 l dung dịch C1 và đảo ngược nhiều lần hoặc lắc thời gian ngắn. - Vortex 5-10 phút ở tốc độ tối đa.

- Ly tâm 10.000 x g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng.

- Chuyển dịch nổi sang ống 2 ml với thể tích mong muốn khoảng 400-500 µl. - Thêm 250 l đệm C2 và lắc trong 5 giây. Ủ ở 4 C trong 5 phút.

- Ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút 10.000 x g.

- Chuyển dịch nổi sang ống 2 ml nhưng không vượt quá 600 l.

- Thêm 200 l đệm C3 và vortex một thời gian ngắn. Ủ ở 4 C trong 5 phút. - Ly tâm các ống ở nhiệt độ phòng trong 1 phút 10.000 x g.

- Chuyển dich nổi vào ống 2 ml không vượt quá 750 l.

- Lắc để trộn đệm C4 trước khi sử dụng. Thêm 1200 l đệm C4, lắc hoặc vortex 5 trong giây.

- Chuyển lần lượt 675 l lên cột tách và ly tâm tại 10.000 x g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng, loại bỏ dịch chảy qua cột và lặp lại cho đến hết dung dịch ở mỗi mẫu.

- Thêm 500 l đệm C5 ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút tại 10.000 x g.

- Loại bỏ các phần dung dịch qua qua cột.

- Chuyển cột tách sang ống 2 ml sạch. - Thêm 100 l đệm C6.

- Ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút tại 10.000 x g.

ADN sau khi tách thành công được bảo quản ở -20oC.

Hình 3.3. Sơ đồ quy trình tách chiết metagenome ADN từ mẫu ruột tôm phục vụ

giải trình tự gen thế hệ mới