0

Công nghệ giải trình tự gen thế hệ thứ hai của Illumina

Một phần của tài liệu (LUẬN VĂN THẠC SĨ) NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG HỆ VI SINH TRONG RUỘT TÔM THẺ CHÂN TRẮNG TẠI TỈNH SÓC TRĂNG BẰNG KỸ THUẬT METAGENOMICS​ (Trang 31-35 )

2. Mục tiêu của đề tài

1.3.3.2. Công nghệ giải trình tự gen thế hệ thứ hai của Illumina

Về cơ bản, công nghệ giải trình tự gen thế hệ thứ hai của Illumina bao gồm bốn bước, cụ thể là bước 1: tạo thư viện bằng cách cắt ADN genome thành các mảnh ADN và chọn lọc các mảnh ADN có kích thước 200-300 bp, sau đó ADN được xử lý để mặc định gắn thêm 1 A vào đầu 3’ hoặc 5’ của mỗi mạch đơn, tiếp đó 2 loại PE adapter có chữ T nhô ra được nối với ADN đích (PE adapter). PE adapter có vùng bám cho mồi PCR vì thế cho phép khuếch đại ADN đích với mồi mà ở đầu 5’ có gắn thêm trình tự Index2-P5 và Index1-P7 (có thể chỉ cần 1 Index cũng được). (tổng cộng phần gắn thêm khoảng 60 nu); bước 2: polony-PCR tạo ra các cluster ADN; bước 3: giải trình tự ADN trong từng cluster; và bước 4: ráp nối các đoạn trình tự ghi nhận được và xử lý kết quả. Các hệ thống máy cho Illumina Seq bao gồm: HiSeq2500, HiSeq3000, HiSeq4000, HiScanSQ, Genome Analyzer Ilx, MiSeq.

Trong công nghệ metagenomics, chất lượng ADN đầu vào để giải trình tự có vai trò quan trọng, ADN được tách chiết phải đại diện cho đầy đủ các vi sinh vật có trong mẫu cũng như đủ chất lượng cho giải trình tự và xây dựng thư viện. Nồng độ và độ tinh sạch của metagenomic ADN tách từ các sinh vật trong môi trường đạt yêu cầu cho giải trình tự thế hệ mới là rất quan trọng. Tuy nhiên, metagenomic ADN tách chiết từ môi trường thường chứa các tạp chất như axit humic, và các cơ chất của axit humic, đây là các chất ức chế phản ứng enzyme làm ảnh hưởng đến quá trình giải trình tự ADN [78]. Do vậy, một vấn đề vẫn còn vướng mắc trong các nghiên cứu metagenomics là tách chiết được metagenomic ADN không bị lẫn các tạp chất. Thêm

vào đó, quá trình tách chiết ADN cho giải trình tự metagenome ở các đối tượng khác nhau yêu cầu một protocol riêng biệt cho từng loại mẫu, do đó có nhiều phương pháp tách chiết ADN khác nhau đã được công bố [11], [19].

Phương pháp tách chiết metagenomic ADN được chia thành 2 bước chính: bước đầu tiên là ly giải tế bào ly giải tế bào vi sinh vật, ở bước thứ 2 là quá trình tách chiết và tinh sạch ADN. Quá trình ly giải tế bào dựa trên 3 nguyên lý chính là vật lý (sử dụng nhiệt độ, sóng siêu âm, nghiền trong nitơ lỏng, sử dụng hạt bead), hóa học (sử dụng hóa chất như SDS, CTAB, Chelax, PVPP) và enzyme (sử dụng các enzyme như Lysozyme, Proteinase K). Các phương pháp này có thể được tiến hành độc lập, nhưng thường được kết hợp với nhau để làm tăng hiệu quả của quá trình tách chiết ADN [49].

Từ những nguyên lý kể trên, nhiều hãng đã phát triển các bộ kit thương mại cho việc tách chiết ADN của hệ vi sinh vật trong môi trường. Hai bộ kit thương mại hóa được sử dụng phổ biến trong tách chiết metagenomic ADN là bộ kit Power Soil™ DNA Isolation (MO-BIO), và bộ kit FastDNA Spin Kit for soil (Qbiogene), chúng dựa trên nguyên lý sử dụng hạt bead để ly giải tế bào kết hợp với ly giải bằng hóa chất, sau đó ADN được tinh sạch qua cột lọc. Bộ kit QIAmp DNA Stool Mini Kit (QIAgen) cũng là một bộ kit được sử dụng phổ biến trong tách chiết Metagenomic ADN trên nhiều đối tượng khác nhau. Nguyên lý của bộ kit dựa trên sự kết hợp giữa ly giải bằng enzyme Proteinase K kết hợp với ly giải bằng nhiệt độ. Cũng dựa trên nguyên lý này, bộ kit Metagenomic DNA Isolaion Kit for Water của hãng Epicentre cũng đã được phát triển và thương mại hóa phục vụ tách chiết metagenome ADN từ nước (http://www.epibio.com).

Ưu điểm của việc sử dụng kit tách chiết ADN là tiết kiệm thời gian và thu được ADN có độ sạch cao do ADN được tinh sạch qua cột có gắn màng silica. Tuy nhiên nhược điểm chính của việc sử dụng kit tách chiết ADN là giá thành và lượng ADN thu được thường thấp hơn so với phương pháp phenol-chloroform [33]. Hơn nữa, từng loại mẫu lại có một đặc thù nhất định, do đó thì việc áp dụng một phương pháp tách chiết ADN cho nhiều loại mẫu chưa hẳn đã đem lại hiệu quả tốt nhất.

Trong nghiên cứu metagenome hệ vi sinh vật trong môi trường nước, quá trình tách chiết ADN cũng dựa trên các nguyên lý cơ bản kể trên nhưng được chia làm 3 bước: bước đầu tiên là loại bỏ các chất rắn lơ lửng bằng vải lọc hoặc ly tâm. Sau đó là thu các tế bào vi khuẩn thông qua màng lọc. Cuối cùng là tách ADN từ màng lọc khuẩn [83]. Khó khăn chính trong quá trình tách chiết ADN từ mẫu nước là lượng sinh khối vi sinh vật thu được ở màng lọc là rất ít, dẫn đến lượng ADN thu được thường không cao.

Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu về tách chiết Metagenomic ADN hệ vi sinh vật trong môi trường nước nói chung, cũng như trong môi trường nước ở các đầm nuôi tôm. Một số nghiên cứu có thể kể đến như nghiên cứu của Urakawa và cộng sự năm 2010, với việc sử dụng 3 phương pháp tách ADN từ nước biển khác nhau gồm 2 phương pháp tách chiết sử dụng kit FastDNA Spin kit for soil (MP Biomedicals); kit UltraClean Soil DNA (MO-BIO) và phương pháp tách chiết còn lại sử dụng Phenol-Chloroform. Kết quả nghiên cứu cho thấy, phương pháp tách chiết sử dụng Phenol-chloroform cho hiệu suất thu hồi ADN, tổng lượng ADN và số bản sao của gen 16S rARN/ng ADN tổng số là cao hơn so với 2 phương pháp sử dụng kit tách chiết [72].

Trong nghiên cứu của Hwang và cộng sự (2012), các tác giả đã so sánh hiệu quả tách chiết ADN hệ vi sinh vật từ màng sinh học (biofilms) hình thành trong hệ thống phân phối nước sinh hoạt (DWDS) phục vụ giải trình tự pyrosequencing, với 5 phương pháp khác nhau gồm: 2 phương pháp sử dụng các bộ kit PowerSoil DNA Isolation (MO-BIO); FastDNA Spin Kit for soil (Qbiogene) và 3 phương pháp khác lần lượt được mô tả bởi Miller và cộng sự (1999); Schmidt và cộng sự (1991); Zhou và cộng sự (1996) [33], [47], [63], [87]. Kết quả cho thấy, phương pháp tách ADN sử dụng bộ kit FastDNA đem lại hiệu quả tách chiết ADN hơn hẳn so với 4 phương pháp còn lại, mặc dù lượng ADN thu được thấp nhưng phương pháp này loại bỏ được tạp nhiễm gây ức chế phản ứng PCR là axit humics.

Trong nghiên cứu metagenome hệ vi sinh vật đường ruột, mẫu ADN tổng số có nồng độ và độ tinh sạch cao từ các mẫu đường ruột là yêu cầu bắt buộc. Tuy nhiên,

hệ vi sinh đường ruột rất phức tạp và chứa rất nhiều vi sinh vật khó ly giải trong quá trình tách chiết [81]. Do đó, đã có rất nhiều các nghiên cứu trên thế giới đã tiến hành tách chiết ADN tổng số từ các mẫu ruột. Các phương pháp không sử dụng kit có thể kể đến như sử dụng các enzyme dung giải, cơ học sử dụng các hạt bead, và hóa học [16], [21], [46], [82]. Hàng loạt các bộ kit thương mại đã được ra đời và sử dụng rộng rãi như QIAamp DNA stool mini kit (Qiagen, Mỹ), FastDNA SPIN kit (Qbiogene, Mỹ), PowerSoil DNA Isolation Kit (MoBio, Mỹ), ZR Fecal DNA MiniPrep (Zymo, Mỹ), PSP Spin Stool DNA Kit (Stratec, Đức). Tuy nhiên, các phương pháp này cũng đã cho thấy sự hạn chế về mức độ tinh sạch và lượng ADN tổng số sau khi tách chiết không cao. Một số nghiên cứu so sánh giữa các phương pháp đã được các nhóm tác giả thực hiện qua đó làm sáng tỏ hơn ưu nhược điểm của các phương pháp [81], [86].

Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Một phần của tài liệu (LUẬN VĂN THẠC SĨ) NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG HỆ VI SINH TRONG RUỘT TÔM THẺ CHÂN TRẮNG TẠI TỈNH SÓC TRĂNG BẰNG KỸ THUẬT METAGENOMICS​ (Trang 31 -35 )

×