3.4.1. Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T0, T1 chuyển cấu trúc rd29A - codA
bằng phản ứng PCR
Khi cây được trồng ra giá thể TN1 trong buồng sinh trưởng sau 30 ngày tiến hành thu mẫu lá tách DNA tổng số để kiểm tra bước đầu cây chuyển gen.
Hình 3.10 Kết quả kiểm tra cây T0 bằng PCR
M: thang DNA chuẩn 1kb; +: khuẩn Agrobacterium mang gen cần chuyển; 1-16 các dòng đậu tương T0 chuyển gen; WT: lá cây đậu tương ĐT22
Từ 23 dòng thu được đem đi tách DNA tổng số để kiểm tra ban đầu kết quả chuyển gen. Kết quả tách chiết DNA tổng số thu được một năng lớn không hề đứt gãy phù hợp dùng để tiếp tục phân tích. Từ lượng DNA tổng số, tiến hành phản ứng PCR với 2 cặp mồi codA F/R và Bar F/R. Thu được 9 dòng cho kết quả dương tính với PCR (Hình 3.10) nhận được 2 băng có kích thước là 750bp và 400bp phù hợp với kích thước của đoạn gen Bar và gen codA.
Thu được 20 cây T1 từ hạt 10 dòng đậu tương T0, sau 20 ngày gieo thu mẫu lá tách DNA để kiểm tra kết quả chuyển gen. Tiến hành phản ứng PCR với 2 cặp mồi
nhận được 2 băng có kích thước khoảng 750bp và 400bp phù hợp với kích thước của đoạn gen bar và gen codA.
Hình 3.11 Kết quả kiểm tra cây T1 bằng PCR
M: thang DNA chuẩn 1kb; +: khuẩn Agrobacterium mang gen cần chuyển; 1-4 các dòng đậu tương T1 chuyển gen.
3.4.2. Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T0 và T1 chuyển cấu trúc rd29A-
codA bằng ppt
Phosphinothricin 250mg/l bổ sung tween 20, dùng tăm bông thấm thuốc thử phết trực tiếp lên bề mặt của lá của cây đậu tương đã biến nạp. Thu kết quả sau 3 -5 ngày.
Hình 3.12 Kết quả kiểm tra các dòng Đậu Tương T0 bằng Phosphinothricin
A: Cây T0 dương tính Phosphinothricin 250mg/l B: Cây T0 âm tính Phosphinothricin 250mg/l C: Cây đối chứng
Hình 3.13 Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T1 bằng Phosphinothricin
A: Cây T1gieo sau 20 ngày
B1: Lá cây T1 dương tính Phosphinothricin 250mg/l
B2: Lá cây T1 có khả năng tự phục hồi với Phosphinothricin 250mg/l
B3: Lá cây T1 âm tính Phosphinothricin 250mg/l.
Từ 23 dòng đậu tương T0 thử trực tiếp với Phosphinothricin 250mg/l tại bề mặt lá. Sau 3 ngày phết thuốc diệt cỏ tại vị trí dùng thuốc thử ở 13 cây lá co lại và mất dần sắc tố xanh lục cả lá mà chuyển sang màu xanh vàng đến 5 ngày thì tại vị trí thử chuyển sang màu vàng, cháy khô. 10 cây còn lại tại vị trí thử lá vẫn nguyên hiện trạng ban đầu hoặc lá hơi co lại nhưng không bị mất màu xanh lục của lá. Như vậy kết quả kiểm tra các dòng T0, thu được 10 dòng dương tính với Phosphinothricin 250mg/l.
Sau khi thu hoạch hạt của các dòng T0 tiến hành gieo để đánh giá các dòng T1. Các cây T1 sau khi nảy mầm 22-25 ngày ta dùng Phosphinothricin 250mg/l bổ sung Tween 20 để kiểm tra khả năng kháng thuốc của các cây T1.
Bảng 3.6 Kết quả kiểm tra các dòng T1 bằng Phosphinothricin 250mg/l
-: Kết quả âm tính; +: Kết quả dương tính; ?: Kết quả có khả năng phục hồi với ppt
Số dòng cây Đậu tương T1 (Giống đậu tương DT22)
T0 T1
STT Tên dòng PCR ppt Tên dòng ppt PCR
1 rd29A codA 1 - + + rd29A codA 1.1 - - - - rd29A codA 1.2 - - - - 2 rd29A codA 2 + + + + rd29A codA 2.1 - - - - 3 rd29A codA 3 + - + + rd29A codA 3 + + + + 4 rd29A codA 4 + + + rd29A codA 4.1 - - - - rd29A codA 4.2 + + + + 5 rd29A codA 5 + + + rd29A codA 5.1 - + - - rd29A codA 5.2 + - ? - rd29A codA 5.3 - - - - 6 rd29A codA 6 + + + + rd29A codA 6.1 - - - - rd29A codA 6.2 - - - - rd29A codA 6.3 - - - - 7 rd29A codA 7 + + + + rd29A codA 7.1 - - - - rd29A codA 7.2 - - - - 8 rd29A codA 8 + + + + rd29A codA 8.1 - - - - rd29A codA 8.2 - - - - 9 rd29A codA 9 + + + + rd29A codA 9 + + + + 10 rd29A codA 10 + + + rd29A codA 10.1 - - + + rd29A codA 10.2 - - - - Kết quả sau 5 ngày kiểm tra thu được 3 dòng dương tính hoàn toàn với thuốc thử và 3 dòng có hiện tượng bị ảnh hưởng nhẹ và hồi phục lại trạng thái ban đầu tại vị trí thử, còn lại 13 dòng thì âm tính hoàn toàn với thuốc thử theo Hình 3.13.
3.4.3. Kết quả xây dựng đường xử lý hạn ở giống đậu tương DT22
Mục đích phục vụ cho kiểm tra hoạt động của vector pIBTII-rd29A-codA ở cây đậu tương chuyển gen. Tiến hành xác định ngưỡng chịu hạn của giống đậu tương ĐT22 này trong điều kiện gây hạn nhân tạo.
Hạt giống đậu tương ĐT22 gieo sau 10 - 12 ngày cây đạt lá V3, cây cao từ 28 cm- 30 cm thì sử dụng cho thí nghiệm. Thí nghiệm được thực hiện trong 15 ngày gây hạn nhân tạo. Đến ngày thứ 12 gây hạn nhân tạo gây chết khô hoàn toàn ở giống đậu
độ: 28oC, độ ẩm: 80%, ánh sáng: 14h/10h sáng tối, bổ sung 10ml nước/cây /ngày vẫn sống và phát triển bình thường.
Hình 3.14 Sinh trưởng của giống DT22 sau 3,6,9,12 thí nghiệm
Sự phát triển thân rễ tại buồng xử lý khô hạn và buồng không xử lý có sự khác biệt, kích thước thân của cây không xử lý khô hạn tăng theo đường tuyến tính đi lên, cây xử lý hạn bắt đầu từ ngày thứ 6 thì dừng sinh trưởng về chiều cao thân. Tại ngày thứ 7 thì sự hình thành lá mới không còn ở cây đặt trong buồng xử lý hạn, kích thước lá co ngắn lại, lá chuyển sang màu xanh lục, lớp lông trên bề mặt lá không còn.
Bộ rễ của cây xử lý khô hạn giảm phát triển từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 9 nhưng tăng trở lại sau ngày thứ 9 -12 khi thân cây ngừng phát triển. Sau 6 ngày đặt trong buồng sinh trưởng bộ rễ tại buồng không xử lý hạn cho bộ rễ to rộng nhiều rễ phụ rễ chính phát triển bình thường, tại buồng xử lý hạn thì chỉ thấy rễ chính phát triển theo chiều kéo dài, kích thước giảm ở các ngày tiếp theo.
Bảng 3.7 Sự phát triển của thân và rễ các cây đậu tương ĐT22 thí nghiệm
Chiều cao thân (cm) chiều dài rễ (cm)
Đk Bình thường Đk hạn nhân tạo Đk Bình thường Đk hạn nhân tạo
3 Ngày 33.83 33.63 25.50 20.33
6 Ngày 43.00 41.83 22.92 19.38
9 Ngày 50.83 37.83 29.00 17.50
12 Ngày 59.33 37.83 24.83 19.25
Hình 3.16 Các cây được phục hồi sau 3, 6, 9,10, 11 ngày gây hạn nhân tạo
Các cây được xử lý hạn sau 3, 6, 9, 10, 11, 12 ngày sẽ được chuyển sang buồng sinh trưởng không xử lý hạn để tiến hành phục hồi. Theo Hình 3.16, ta quan sát thấy các cây sau 3 và 6 ngày gây hạn phục hồi phát triển tốt, hình thái cây và thời gian ra hoa đậu quả hoàn toàn kịp với các cây không xử lý hạn. Các cây sau 9 ngày và 10 ngày gây hạn sinh trưởng và phát triển chậm hơn, thân cây bé và ra hoa đậu quả muộn hơn số lượng quả kém. Cây sau 11 ngày xử lý hạn cây vẫn sống và phát triển lá mới nhưng không tạo hoa và đậu quả cùng thời điểm với các dòng xử lý chịu hạn và khả năng thu được nhiều hạt giảm. Vậy các yếu tố hạn hán ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh trưởng phát triển của giống đậu tương DT22, giới hạn sống của giống đậu tương DT22 trong điều kiện xử lý khô hạn nhiệt độ: 33oC, độ ẩm: 55%, ánh sáng: 14h/10h sáng/tối, không bổ sung nước là 12 ngày, sau 9 ngày gây hạn thì cây sinh trưởng và phát triển chậm. Không tạo quả kịp sau 11 ngày gây hạn, ngừng phát triển không phục hồi được sau 12 ngày gây hạn.
gen đích ở mức độ mRNA, protein và sự gia tăng tích luỹ hàm lượng glycine betain ở các dòng đậu tương chuyển gen chịu hạn trong các điều kiện thí nghiệm gây hạn nhân tạo sau 9-12 ngày gây hạn.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1. Đã thiết kế thành công vector chuyển gen pIBTII-rd29A-codA. Trong đó promoter cảm ứng khô hạn điều khiển hoạt động của gen codA.
2. Đã biến nạp thành công vector chuyển gen mang gen codA vào giống thuốc lá K326 thu được 19 dòng, trong đó có 12 dòng xuất hiện băng vạch có kích thước của đoạn gen codA và gen bar trong phản ứng PCR với 2 cặp mồi codA F/R và Bar F/R. Kết quả xử lý hạn và định lượng GB đã chứng minh được các dòng thuốc lá chuyển gen có khả năng chịu hạn nhân tạo cao hơn so với cây đối chứng không chuyển gen.
3. Đã biến nạp thành công vector chuyển gen mang gen codA vào giống đậu tương ĐT22 thu được 23 dòng T0, trong đó có 10 dòng dương tính với thuốc diệt cỏ 250mg/l và 9 dòng xuất hiện băng vạch có kích thước của đoạn gen codA và gen bar trong phản ứng PCR với 2 cặp mồi CodA F/R và Bar F/R. Bước đầu đánh giá và kiểm tra các dòng T1 chuyển gen codA bằng phản ứng PCR và thuốc diệt cỏ 250mg/l, thu được 4 các dòng dương tính với PCR và thuốc diệt cỏ.
4. Xác định được chỉ tiêu liên quan đến tính chống chịu của cây với strees môi
trường: độ dài rễ, trọng lương tươi, trọng lượng khô từ đó xây dựng được phương pháp đánh giá các dòng chuyển gen chịu hạn trong điều kiện phòng thí nghiệm.
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục đánh giá và kiểm tra các dòng đậu tương T1, T2 và các thế hệ sau bằng thuốc diệt cỏ và phản ứng PCR với 2 cặp mồi codA F/R và Bar F/R.
2. Xác định sự có mặt và gắn kết ổn định của gen chuyển trong các dòng đậu
tương chuyển gen bằng Southern blot và đánh giá biểu hiện gen ở mức độ phiên mã và biểu hiện protein đích dưới điều kiện xử lý hạn.
3. Định lượng hàm lượng GB ở các dòng đậu tương chuyển gen, xác định khả
năng hoạt động của gen codA điều khiển bởi promoter cảm ứng khô hạn rd29A.
4. Đánh giá kiểm tra các cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T1 trong điều kiện xử
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Trần Văn Điền. Giáo Trình Cây Đậu Tương. nhà xuất bản nông nghiệp, 2007. 2. Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Nguyễn Hữu Kiên, Dương Tuấn Bảo,
(2013) “Nghiên cứu biến nạp gene liên quan dến khả năng kháng hạn và kháng thuốc trừ cỏ vào giống đậu tương ĐT22.” Tạp Chí KHCN. Bộ NNPTNT, vol. 1.
3. Lê Tiến Dũng, Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Trần Phan Lam Sơn, (2013) “Những kết quả gần đây về nghiên cứu chức năng gen đậu tương trong điều kiện khô hạn.” Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Sinh Học Toàn Quốc, pp. 747–751.
4. Nguyễn Tiến Dũng, Ngô Xuân Bình, Hà Văn Chiến, Nguyễn Xuân Đồng, (2010) “Nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen của một số giống đậu tương [Glycine Max (L.) Merr.] Của việt nam thông qua vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens.” Tạp Chí Nông Nghiệp & Phát Triển Nông Thôn, vol. 11, pp. 69– 74.
5. Nguyễn Thị Thu Hiền. "Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của Virus H5N1 vào cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật“. Luận án tiến sĩ 2014.
6. Trần Thị Cúc Hòa, (2008) “Hiệu quả tạo dòng đậu tương biến đổi gene từ giống MTĐ 176, HL 202 Maverick và William 82 bằng phương pháp nốt lá mầm qua trung gian Agrobacterium Tumefaciens.” Tạp Chí Nông Nghiệp & Phát Triển Nông Thôn, vol. 1, pp. 14–19.
7. Trần Thị Cúc Hòa, (2013) “Nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương kháng ruồi đục thân và sâu đục quả.” Hội Thảo Quốc Gia về Khoa Học Cây Trồng Lần Thứ Nhất, pp. 441–446.
8. Trần Thị Cúc Hòa, Phạm Trung Nghĩa, Trần Ngọc Thạch, Hồ Thị Huỳnh Như, Lã Cao Thắng, Trần Thanh Hải, Nguyễn Trần Hải Bằng, Võ Thị Kiều Trang (2015) “Tạo dòng đậu tương chuyển gene kháng sâu và chịu hạn.” Chuyên Đề Nghiên Cứu Phát Triển và Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong Nông Nghiệp Tháng 6/2015, pp. 19–26.
9. Nguyễn Thị Thúy Hường. “phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương Việt Nam”. Luận án tiến sĩ 2011.
10.Trần Thị Phương Liên, (2010) “Protein và tính chống chịu ở thực vật.” NXB Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Hà Nội.
11.Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Tường Vân, Nông Văn Hải, Chu Hoàng Hà, (2010) “Tách dòng và xác định trình tự cDNA của gen GS1 ở cây đậu tương (Glycine Max L.).” Công Nghệ Sinh Học, vol. 8, No. 3A, pp. 499– 504.
12.Bùi Phương Thảo, Lê Thị Thủy, Nguyễn Tường Vân, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà, Trần Thanh Thu, G.Angeneon, Lê Văn Sơn , (2009) “Nghiên cứu tạo cây đậu tương chuyển gene mang cấu trúc biểu hiện gene mã hóa kháng nguyên HA của Virus A/H5N1.” Hội Nghị KHCN Toàn Quốc Thái Nguyên, pp. 868–872.
13.Lê Thị Thủy, Lê Văn Sơn, Bùi Phương Thảo, Chu Hoàng Hà, (2010) “Nghiên cứu tái sinh cây đậu tương (Glycine Max L.) thông qua nách lá mầm hạt Chín.”
Tạp Chí KHCN ĐH Quốc Gia HN, vol. 26, No. 2S, pp. 247–254.
Tiếng Anh
14.Alia, Hayashi H, Chen THH, Muratat N, “Transformation with a gene for choline oxidase enhances the cold tolerance of arabidopsis during germination and early growth.” Plant Cell Environ, vol. 21, pp. 232–239.
15.Allakhverdiev, Suleyman I., Dmitry A. Los, Prasanna Mohanty, Yoshitaka Nishiyama, Murata, Norio., (2007) “Glycinebetaine alleviates the inhibitory effect of moderate heat stress on the repair of photosystem II during photoinhibition.” Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics, vol. 1767, No. 12, pp. 1363–1371.
16.Ashraf, M., (2009) “Biotechnological approach of improving plant salt tolerance using antioxidants as markers.” Biotechnology Adv, vol. 27, pp. 84– 93.
17.Bai Xianquan, Qiuyun Wang, Chengcai Chu, (2008) “Excision of a selective marker in transgenic rice using a novel creloxp system controlled by a floral specific promoter.” Transgenic Research, vol. 17, No. 6, pp. 1035–1043.
18.Berry JA, and Björkman O., (1980) “Photosynthetic response and adaptation to temperature in higher plants.” Annu Rev Plant Physiol, vol. 31, pp. 491–543. 19.Bohnert, H. J., (1995) “Adaptations to environmental stresses.” The Plant Cell
Online, vol. 7, no. 7, pp. 1099–1111.
20.Boynton John E.Nicholas W.Gillham, Elizabeth H. Harris, Jonathan P. Holesr, Anita, M.Johnson, Allan R.jones, Barbara L.randoph-Anderson, Dminiqe Robertson, Ted M. klien, Katherine B. Shark, John C Sanfor, (1988) “Chloroplast transformation in chlamydomonas with high velocity microprojectiles.” Science, vol. 1482.
21.Cerezini Paula, Lima Santos, Antonio Eduardo Pípolo, Mariangela Hungria, Marco Antonio Nogueira, (2017) “Water restriction and physiological traits in soybean genotypes contrasting for nitrogen fixation drought tolerance.” Scientia Agricola, vol. 74, No. 2, pp. 110–117.
22.Crossway Anne, Oakes Janette V., Irvine Jonathan M., Ward Barney, Knauf Vic C., Shewmaker C. K. (1986) “Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts.” MGG Molecular & General Genetics, vol. 202, No. 2, pp. 179–185.
23.Dang, Wei, and Zhi ming Wei, (2007) “An optimized agrobacterium-mediated transformation for soybean for expression of binary insect resistance genes.”
Plant Science, vol. 173, Elsevier B.V., pp. 381–389.
24.Davey Michael R., Anthony Paul, Power J. Brian, Lowe Kenneth C. (2005) “Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives.” Biotechnology Advances, vol. 23, No. 2 , pp. 131–171.
25.Depicker, A., Herman, L; Jacobs, A; Schell, J; (1985) “Frequencies of simultaneous transformation with different T-DNAs and their relevance to the
26.Fukuda, Y., (1933) “Cytogenetical studies on the wild and cultivated manchurian soybeans (GlycineL.).” Japanese Journal of Botany, vol. 6, pp. 489–506.
27.Gorhan, John., (1995) “Betaines in higher plants ”– Biosynthesis and Role in Stress Metabolism.
28.Haldimann, P., and U. Feller, (2004) “Inhibition of photosynthesis by high temperature in oak (Quercus Pubescens L.) leaves grown under natural conditions closely correlates with a reversible heat-dependent reduction of the activation state of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase.” Plant, Cell and Environment, vol. 27, No. 9, pp. 1169–1183.
29.Haldimann, Pierre, and Urs Feller, (2005) “Growth at moderately elevated temperature alters the physiological response of the photosynthetic apparatus to heat stress in pea (Pisum Sativum L.) leaves.” Plant, Cell and Environment,
vol. 28, No. 3, pp. 302–317.
30.Hamilton, E. W., and S. a Heckathorn, (2001) “Mitochondrial adaptations to naCl. Complex I is protected by anti-oxidants and small heat shock proteins,