K326.
Nhằm mục đích kiểm tra hoạt động của vector chuyển gen pIBTII-rd29A-codA,
chúng tôi tiến hành chuyển vào cây mô hình thuốc lá giống K326 và thử nghiệm kiểm tra hoạt động.
Kết quả thu được sau các đợt biến nạp cho thấy sau 15 ngày đa số các mảnh lá đều mọc lên các cụm chồi ở các mép lá. Trong khi đó, mẫu đối chứng âm không chuyển gen đưa vào môi trường chọn lọc bị vàng và chết dần đi không thấy hiện tượng phát sinh chồi, một vài mảnh lá có hiện tượng phát sinh chồi nhưng sau đó đều vàng và rụng đi (Hình 3.5). Kết quả tạo chồi cho thấy các đợt biến nạp đều có tỷ lệ tạo chồi cao đạt 80%, tuy nhiên cũng có những mảnh lá không tạo chồi chiếm 20%. Từ các cụm chồi thu được 68 chồi vào môi trường MS4 (phụ lục 3) và thu được 27 cây sống sót và tạo rễ. Kết quả thu được 19 cây sống và ra cây bằng giá thể TN1 trong nhà lưới.
Bảng 3.1. Tỷ lệ sống sót của các mảnh thuốc lá biến nạp qua các giai đoạn chọn lọc.
Số lần biến nạp Số mẫu biến nạp Số mẫu tạo chồi Số chồi cắt cho ra rễ Số chồi sống tạo rễ Số cây cho ra chấu cát 1 25 21 36 15 10 2 25 19 32 12 9 Tổng 50 40 68 27 19
Hình 3.5 Các giai đoạn của quá trình chuyển gen ở thuốc lá 3.2.2. Kết quả đánh giá và phân tích các dòng thuốc lá chuyển gen
Chọn ngẫu nhiên 12 dòng thuốc lá chuyển sống sau chọn lọc bằng ppt phân tích PCR với 2 cặp mồi codA F/R và Bar F/R thu được cả 12 dòng xuất hiện băng vạch có kích thước của đoạn gen codA và gen bar trong phản ứng PCR. Kết quả được trình bày trong (Hình 3.6) nhận được băng có kích thước khoảng 750 bp và 400 bp phù hợp với kích thước của đoạn gen codA và gen Bar.
Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng thuốc lá
M: thang DNA chuẩn 1kb; +: khuẩn Agrobacterium mang gen cần chuyển; 1-12 các dòng thuốc lá chuyển gen; -: lá cây thuốc lá k326
3.2.3. Kết quả đánh giá khả năng chống chịu của các dòng thuốc lá chuyển gen
Tiến hành gây hạn nhân tạo in vitro với 6 dòng thuốc lá chuyển gen trong 12 dòng cho kết quả kiểm tra có băng vạch gen codA trong phản ứng PCR nhằm bước đầu đánh giá sự hoạt động của gen chuyển dưới sự điều khiển của promoter rd29A, có làm tăng cường hoạt động của gen codA trong cây thuốc lá chuyển gen từ đó tăng cường khả năng chịu hạn hay không.
Tiến hành gây hạn nhân tạo 30 ngày, theo (bảng 3.2) ở giai đoạn gây hạn 7 ngày và 14 ngày các mảnh lá chuyển gen đều xanh và tạo chồi đạt 68%, các mảnh lá cây đối chứng chuyển màu vàng và tạo đa chồi ít đạt 31%. Các chồi chuyển gen được cắt và chuyển sang môi trường chịu hạn nhân tạo đều tạo rễ sau 10 ngày cấy chuyển và các chồi cây đối chứng thì không tạo rễ cây phát triển không bình thường. Kết quả cho thấy khả năng chịu hạn của cây chuyển gen được tăng cường so với cây đối chứng ở môi trường gây hạn nhân tạo in vitro.
Bảng 3.2 Kết quả gây hạn nhân tạo các dòng thuốc lá chuyển gen
7 ngày 14 ngày STT Số mảnh lá Số chồi Số mảnh lá tạo chồi Số chồi tạo rễ Số mảnh lá tạo chồi Số chồi tạo rễ 1 16 12 9 6 14 10 2 16 12 11 8 13 10 3 16 12 9 7 15 12 4 16 12 12 5 12 11 5 16 12 11 8 12 12 6 16 12 14 6 15 10 Tổng 96 72 66 40 81 65 ĐC 16 12 8 1 12 5
Hình 3.7 Kết quả gây hạn nhân tạo các dòng thuốc lá chuyển gen
A: Chồi ĐC ở môi trường hạn nhân tạo; B: Chồi chuyển gen ở môi trường hạn nhân tạo
Từ Bảng 3.2, sức chống chịu các dòng chuyển gen rd29A-codA đều cao hơn dòng đối chứng. Tuy nhiên, ở các dòng thuốc lá chuyển gen thì mức độ chịu hạn cũng khác nhau. Điều này là do có thể vị trí gen được chuyển vào các vị trí khác nhau trong tế bào nên có dòng được tăng cường hoạt động, có một số dòng bị ức chế hoạt động. Ngoài ra 1 nguyên nhân nữa cũng có thể dẫn tới hiện tượng các dòng có khả năng chịu hạn khác nhau là những dòng cây chỉ có duy nhất một bản copy, vì số lượng bản copy càng nhiều thì càng bị ức chế hoạt động.
3.3. KẾT QUẢ CHUYỂN GEN CODA VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT22 3.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ khuẩn A. tumefacien sử dụng cho biến nạp đến 3.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ khuẩn A. tumefacien sử dụng cho biến nạp đến khả năng cảm ứng tạo chồi
Khuẩn Agrobacterium đã được biến nạp mang cấu trúc rd29A-codA được nuôi trên môi trường YEP đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc. Để xác định nồng độ
Agrobacterium tối ưu sử dụng cho biến nạp đậu tương, 4 nồng độ khuẩn ở OD650 ( 0,4; 0,6; 0,8; 1) đã được sử dụng. Lây nhiễm 30 phút mảnh lá mầm với dịch khuẩn ở các nồng độ khác nhau tiến hành đồng nuôi cấy 5 ngày, rửa khuẩn cấy chuyển sang môi trường cảm ứng tạo chồi. Theo (Bảng 3.3) sau 14 ngày cảm ứng tạo chồi tại SIM1 không có ppt ta không thấy sự sai khác nhiều về khả năng tạo chồi ở 2 nồng độ OD650
0,4; 0,6 là không có sự sai khác đạt 75%, tại OD650 0,8; 1,0 tái nhiễm khuẩn rất cao và các mảnh lá mầm chết, không tạo đa chồi. Tại SIM2 có bổ sung ppt sau 14 ngày tiếp
kém. Do đó, chúng tôi kết luận rằng nồng độ tối ưu của Agrobacterium là: OD650 (0,6)
Bảng 3.3 Ảnh hưởng cuả nồng độ khuẩn đến khả năng cảm ứng tạo chồi
Nồng độ Agrobacterium đo ở OD650 Số mảnh lá mầm thí nghiệm Số mảnh lá mầm cảm ứng tạo chồi trên mt (SIM1) Số mảnh lá mầm cảm ứng tạo chồi trên mt (SIM 2) 0.4 60 48 12 0.6 60 45 18 0.8 60 29 11 1.0 60 20 10 Tổng 240 98 55
3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ Phosphinothricin (ppt) đến hiệu quả chuyển gen
Để xác định hàm lượng ppt sử dụng chọn lọc các chồi chuyển gen thí nghiệm với 5 nồng độ ppt (0; 1; 3; 5; 7) mg/l bổ sung vào môi trường SIM 2.
Sau 15 ngày các cụm chồi đặt trên môi trường SIM 2 + ppt, theo (Bảng 3.4) tỉ lệ tạo chồi đã đạt tương đối ổn định và không tăng khi nuôi cấy thời gian lâu hơn. Nồng độ ppt thấp: 0 mg/l và 1mg/l cụm chồi xanh và phát triển bình thường, trong khoảng nồng độ ppt từ 3 - 5 mg/l 100% mẫu chịu ảnh hưởng của ppt lá úa vàng vàng rụng ở ngày thứ 7 trên SIM2, ở nồng độ 7 mg/l các cụm chồi chết khô hoàn toàn tại ngày thứ 8. Tuy nhiên, tỉ lệ tạo chồi xanh và chồi kéo dài giảm theo sự tăng nồng độ của ppt. Ở nồng độ (3; 5) mg/l ppt hai chỉ tiêu này giảm đi rõ rệt. Sau khoảng 30 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung ppt, đã có sự khác biệt về sinh trưởng của chồi trên các môi trường bổ sung các nồng độ ppt khác nhau. Các môi trường bổ sung nồng độ ppt 3 mg/l, chồi vẫn sinh trưởng phát triển nhưng chậm, có tạo cụm chồi mới xanh. Nồng độ ppt 5 mg/l tỉ lệ cụm đa chồi chết hoàn toàn, kết quả theo (Hình 3.8). Như vậy, từ các kết quả này chúng tôi lựa chọn môi trường bổ sung ppt 3mg/l để chọn lọc cây chuyển gen.
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ ppt đến khả năng tạo chồi
Hình 3.8 Các mảnh lá mầm trên môi trường chọn lọc với nồng độ ppt khác nhau
A: 3mg/l ppt; B: 5mg/l ppt; C: 7mg/l ppt
3.3.3. Kết quả chuyển cấu trúc pIBTII-rd29A-codA vào đậu tương
Giống đậu tương tiến hành nghiên cứu là giống ĐT22 được chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens có chứa vector pIBTII-rd29A-codA. Kết quả thu được trình bày theo (Bảng 3.5). Nồng độ ppt mg/l Số mảnh lá mầm thí nghiệm Môi trường chọn lọc Số mảnh lá trên mt SIM1 Số cụm chồi trên mt SIM2 Số cụm chồi trên mt SEM 0 100 82 82 78 1 100 83 45 38 3 100 86 23 16 5 100 79 16 0 7 100 81 0 0
Bảng 3.5. Kết quả biến nạp vector chuyển gen vào mảnh lá mầm đậu tương
Lô thí nghiệm
Số mẫu
biến nạp Số mẫu tạo đa chồi Số mẫu kéo dài
Số chồi tạo
rễ Số cây sống trên giá thể
1 298 182 11 5 1 2 318 219 14 6 2 3 282 261 11 7 1 4 326 197 13 6 2 5 314 279 22 11 3 6 278 262 12 4 3 7 304 211 16 5 4 8 316 206 12 8 2 9 301 192 14 5 2 10 288 216 15 12 3 Tổng 3025 2225 140 69 23
Số lượng mẫu biến nạp là 3025 trong đó 2225 mẫu tạo đa chồi, chiếm tỉ lệ 73,55%. Từ các cụm chồi này thu được 140 chồi kéo dài ở các giai đoạn khác nhau; có thể ở giai đoạn kéo dài chồi SEM lần 1, lần 2 hoặc lần 3; chiếm tỷ 4,63%. Các chồi mọc cao đến một kích thước nhất định 2,5 – 3,5 cm và đã có các lá chính, cắt sang môi trường tạo rễ chứa kháng sinh cefotaxim 250mg/l. Trong môi trường tạo rễ RM, các chồi ra rễ là 69 chồi. Chất lượng rễ ở các chồi là khác nhau, có những chồi không ra rễ. Chọn lọc các chồi ra rễ tạo cây hoàn chỉnh, tiến hành trồng cây này trong giá thể TN1 bổ sung 25% chibat có 23 cây sống sót và phát triển bình thường khi đặt trong buồng sinh trưởng nhiệt độ 28oC, Độ ẩm 80%, ánh sáng: 16h/8h (sáng/tối). Các giai đoạn phát triển cụ thể được trình bày trong (Hình 3.9).
3.4. PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC DÒNG ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN 3.4.1. Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T0, T1 chuyển cấu trúc rd29A - codA 3.4.1. Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T0, T1 chuyển cấu trúc rd29A - codA
bằng phản ứng PCR
Khi cây được trồng ra giá thể TN1 trong buồng sinh trưởng sau 30 ngày tiến hành thu mẫu lá tách DNA tổng số để kiểm tra bước đầu cây chuyển gen.
Hình 3.10 Kết quả kiểm tra cây T0 bằng PCR
M: thang DNA chuẩn 1kb; +: khuẩn Agrobacterium mang gen cần chuyển; 1-16 các dòng đậu tương T0 chuyển gen; WT: lá cây đậu tương ĐT22
Từ 23 dòng thu được đem đi tách DNA tổng số để kiểm tra ban đầu kết quả chuyển gen. Kết quả tách chiết DNA tổng số thu được một năng lớn không hề đứt gãy phù hợp dùng để tiếp tục phân tích. Từ lượng DNA tổng số, tiến hành phản ứng PCR với 2 cặp mồi codA F/R và Bar F/R. Thu được 9 dòng cho kết quả dương tính với PCR (Hình 3.10) nhận được 2 băng có kích thước là 750bp và 400bp phù hợp với kích thước của đoạn gen Bar và gen codA.
Thu được 20 cây T1 từ hạt 10 dòng đậu tương T0, sau 20 ngày gieo thu mẫu lá tách DNA để kiểm tra kết quả chuyển gen. Tiến hành phản ứng PCR với 2 cặp mồi
nhận được 2 băng có kích thước khoảng 750bp và 400bp phù hợp với kích thước của đoạn gen bar và gen codA.
Hình 3.11 Kết quả kiểm tra cây T1 bằng PCR
M: thang DNA chuẩn 1kb; +: khuẩn Agrobacterium mang gen cần chuyển; 1-4 các dòng đậu tương T1 chuyển gen.
3.4.2. Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T0 và T1 chuyển cấu trúc rd29A-
codA bằng ppt
Phosphinothricin 250mg/l bổ sung tween 20, dùng tăm bông thấm thuốc thử phết trực tiếp lên bề mặt của lá của cây đậu tương đã biến nạp. Thu kết quả sau 3 -5 ngày.
Hình 3.12 Kết quả kiểm tra các dòng Đậu Tương T0 bằng Phosphinothricin
A: Cây T0 dương tính Phosphinothricin 250mg/l B: Cây T0 âm tính Phosphinothricin 250mg/l C: Cây đối chứng
Hình 3.13 Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T1 bằng Phosphinothricin
A: Cây T1gieo sau 20 ngày
B1: Lá cây T1 dương tính Phosphinothricin 250mg/l
B2: Lá cây T1 có khả năng tự phục hồi với Phosphinothricin 250mg/l
B3: Lá cây T1 âm tính Phosphinothricin 250mg/l.
Từ 23 dòng đậu tương T0 thử trực tiếp với Phosphinothricin 250mg/l tại bề mặt lá. Sau 3 ngày phết thuốc diệt cỏ tại vị trí dùng thuốc thử ở 13 cây lá co lại và mất dần sắc tố xanh lục cả lá mà chuyển sang màu xanh vàng đến 5 ngày thì tại vị trí thử chuyển sang màu vàng, cháy khô. 10 cây còn lại tại vị trí thử lá vẫn nguyên hiện trạng ban đầu hoặc lá hơi co lại nhưng không bị mất màu xanh lục của lá. Như vậy kết quả kiểm tra các dòng T0, thu được 10 dòng dương tính với Phosphinothricin 250mg/l.
Sau khi thu hoạch hạt của các dòng T0 tiến hành gieo để đánh giá các dòng T1. Các cây T1 sau khi nảy mầm 22-25 ngày ta dùng Phosphinothricin 250mg/l bổ sung Tween 20 để kiểm tra khả năng kháng thuốc của các cây T1.
Bảng 3.6 Kết quả kiểm tra các dòng T1 bằng Phosphinothricin 250mg/l
-: Kết quả âm tính; +: Kết quả dương tính; ?: Kết quả có khả năng phục hồi với ppt
Số dòng cây Đậu tương T1 (Giống đậu tương DT22)
T0 T1
STT Tên dòng PCR ppt Tên dòng ppt PCR
1 rd29A codA 1 - + + rd29A codA 1.1 - - - - rd29A codA 1.2 - - - - 2 rd29A codA 2 + + + + rd29A codA 2.1 - - - - 3 rd29A codA 3 + - + + rd29A codA 3 + + + + 4 rd29A codA 4 + + + rd29A codA 4.1 - - - - rd29A codA 4.2 + + + + 5 rd29A codA 5 + + + rd29A codA 5.1 - + - - rd29A codA 5.2 + - ? - rd29A codA 5.3 - - - - 6 rd29A codA 6 + + + + rd29A codA 6.1 - - - - rd29A codA 6.2 - - - - rd29A codA 6.3 - - - - 7 rd29A codA 7 + + + + rd29A codA 7.1 - - - - rd29A codA 7.2 - - - - 8 rd29A codA 8 + + + + rd29A codA 8.1 - - - - rd29A codA 8.2 - - - - 9 rd29A codA 9 + + + + rd29A codA 9 + + + + 10 rd29A codA 10 + + + rd29A codA 10.1 - - + + rd29A codA 10.2 - - - - Kết quả sau 5 ngày kiểm tra thu được 3 dòng dương tính hoàn toàn với thuốc thử và 3 dòng có hiện tượng bị ảnh hưởng nhẹ và hồi phục lại trạng thái ban đầu tại vị trí thử, còn lại 13 dòng thì âm tính hoàn toàn với thuốc thử theo Hình 3.13.
3.4.3. Kết quả xây dựng đường xử lý hạn ở giống đậu tương DT22
Mục đích phục vụ cho kiểm tra hoạt động của vector pIBTII-rd29A-codA ở cây đậu tương chuyển gen. Tiến hành xác định ngưỡng chịu hạn của giống đậu tương ĐT22 này trong điều kiện gây hạn nhân tạo.
Hạt giống đậu tương ĐT22 gieo sau 10 - 12 ngày cây đạt lá V3, cây cao từ 28 cm- 30 cm thì sử dụng cho thí nghiệm. Thí nghiệm được thực hiện trong 15 ngày gây hạn nhân tạo. Đến ngày thứ 12 gây hạn nhân tạo gây chết khô hoàn toàn ở giống đậu
độ: 28oC, độ ẩm: 80%, ánh sáng: 14h/10h sáng tối, bổ sung 10ml nước/cây /ngày vẫn sống và phát triển bình thường.
Hình 3.14 Sinh trưởng của giống DT22 sau 3,6,9,12 thí nghiệm
Sự phát triển thân rễ tại buồng xử lý khô hạn và buồng không xử lý có sự khác biệt, kích thước thân của cây không xử lý khô hạn tăng theo đường tuyến tính đi lên, cây xử lý hạn bắt đầu từ ngày thứ 6 thì dừng sinh trưởng về chiều cao thân. Tại ngày thứ 7 thì sự hình thành lá mới không còn ở cây đặt trong buồng xử lý hạn, kích thước lá co ngắn lại, lá chuyển sang màu xanh lục, lớp lông trên bề mặt lá không còn.
Bộ rễ của cây xử lý khô hạn giảm phát triển từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 9 nhưng tăng trở lại sau ngày thứ 9 -12 khi thân cây ngừng phát triển. Sau 6 ngày đặt trong buồng sinh trưởng bộ rễ tại buồng không xử lý hạn cho bộ rễ to rộng nhiều rễ phụ rễ