Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Các thí nghiệm của phần nuôi cây mô tế bào thực vật đựơc thực hiện trong phòng nuôi cây với điều kiện chiếu sáng theo quang chu kì 16 giờ sáng và 8 giờ tối, nhiệt độ phòng 25oC ± 2, cường độ chiếu sáng 2000lux. Phương pháp tái sinh cây qua đa chồi từ nách lá mầm
tiến.
Kí hiệu và thành phần các loại môi trường sử dụng cho tái sinh cây qua đa chồi từ nách lá mầm hạt chín được chỉ ra trong (phụ lục 4).
Hình 2.1 Sơ đồ khái quát thí nghiệm tái sinh cây đậu tương qua đa chồi từ nách lá
mầm hạt chín
Chủng vi khuẩn Agrobacterium có chứa gen quan tâm được bảo quản trong glycerol trong tủ -80o được nuôi trong YEP lỏng (phụ lục 1) có bổ sung kháng sinh chọn lọc, nuôi lắc 200 v/ph trong điều kiện 28oC qua đêm, sau đó cấy trên môi trường YEP đặc chứa kháng sinh chọn lọc, nuôi tối 2 ngày ở điều kiện 28oC. Chọn khuẩn lạc tròn đều đứng độc lập phục vụ cho biến nạp, mức OD650 đặt từ 0,6 – 0,8 là phù hợp cho biến nạp. Sau đó đem li tâm lạnh thu lấy cặn khuẩn, cặn khuẩn được hòa tan với dung dịch CCM1 (phụ lục 4) tạo thành dịch huyền phù khuẩn.
Hạt chín được chọn lọc, loại bỏ những hạt kém chất lượng và tiến hành khử trùng bằng khí clo. Khí clo được tạo ra bằng cách bổ sung vào 100 ml javen 4 ml HCl 37%. Việc khử trùng được thực hiện trong một bình kín và đặt trong tủ hút. Sau khi
tách đôi hai lá mầm, loại đỉnh sinh trưởng, phần lá mầm còn lại tạo 5-7 vết thương tại vị trí chồi chính bị loại bỏ và sử dụng làm nguyên liệu biến nạp.
Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy: Môi trường đồng nuôi cấy là CCM đặc có bổ sung AS. CCM được đổ trên đĩa petri, khi khô đặt giấy thấm đã khử trùng lên trên bề mặt môi trường. Mẫu được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn trong thời gian 30 phút. Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy CCM đặc. Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 250C trong thời gian là 5 ngày.
Diệt khuẩn và tạo đa chồi: Mẫu biến nạp sau thời gian đồng nuôi cấy được lắc trong môi trường SIM lỏng có bổ sung 500 mg/l cefotaxim với thời gian là 10 phút, sau đó thấm khô bằng giấy thấm khử trùng. Dùng panh và dao cắt bỏ chồi chính xuất hiện trên các mảnh lá mầm, cấy mẫu lên môi trường tạo cụm chồi có bổ sung 500 mg/l cefotaxim. Sau thời gian 2 tuần, mẫu được chuyển sang môi trường SIM đặc có bổ sung 500 mg/l cefotaxim, 3 mg/l ppt và nuôi trong 2 tuần.
Tái sinh cây hoàn chỉnh: Các cụm chồi sống được trên môi trường chọn lọc sẽ được chuyển sang môi trường phát triển chồi SEM có bổ sung 500 mg/l cefotaxim và 3 mg/l ppt. Khi các chồi phát triển đạt kích thước từ 3 - 5 cm sẽ được chuyển sang môi trường ra rễ RM có bổ sung 250 mg/l cefotaxim để tạo cây hoàn chỉnh.