3.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ khuẩn A. tumefacien sử dụng cho biến nạp đến khả năng cảm ứng tạo chồi
Khuẩn Agrobacterium đã được biến nạp mang cấu trúc rd29A-codA được nuôi trên môi trường YEP đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc. Để xác định nồng độ
Agrobacterium tối ưu sử dụng cho biến nạp đậu tương, 4 nồng độ khuẩn ở OD650 ( 0,4; 0,6; 0,8; 1) đã được sử dụng. Lây nhiễm 30 phút mảnh lá mầm với dịch khuẩn ở các nồng độ khác nhau tiến hành đồng nuôi cấy 5 ngày, rửa khuẩn cấy chuyển sang môi trường cảm ứng tạo chồi. Theo (Bảng 3.3) sau 14 ngày cảm ứng tạo chồi tại SIM1 không có ppt ta không thấy sự sai khác nhiều về khả năng tạo chồi ở 2 nồng độ OD650
0,4; 0,6 là không có sự sai khác đạt 75%, tại OD650 0,8; 1,0 tái nhiễm khuẩn rất cao và các mảnh lá mầm chết, không tạo đa chồi. Tại SIM2 có bổ sung ppt sau 14 ngày tiếp
kém. Do đó, chúng tôi kết luận rằng nồng độ tối ưu của Agrobacterium là: OD650 (0,6)
Bảng 3.3 Ảnh hưởng cuả nồng độ khuẩn đến khả năng cảm ứng tạo chồi
Nồng độ Agrobacterium đo ở OD650 Số mảnh lá mầm thí nghiệm Số mảnh lá mầm cảm ứng tạo chồi trên mt (SIM1) Số mảnh lá mầm cảm ứng tạo chồi trên mt (SIM 2) 0.4 60 48 12 0.6 60 45 18 0.8 60 29 11 1.0 60 20 10 Tổng 240 98 55
3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ Phosphinothricin (ppt) đến hiệu quả chuyển gen
Để xác định hàm lượng ppt sử dụng chọn lọc các chồi chuyển gen thí nghiệm với 5 nồng độ ppt (0; 1; 3; 5; 7) mg/l bổ sung vào môi trường SIM 2.
Sau 15 ngày các cụm chồi đặt trên môi trường SIM 2 + ppt, theo (Bảng 3.4) tỉ lệ tạo chồi đã đạt tương đối ổn định và không tăng khi nuôi cấy thời gian lâu hơn. Nồng độ ppt thấp: 0 mg/l và 1mg/l cụm chồi xanh và phát triển bình thường, trong khoảng nồng độ ppt từ 3 - 5 mg/l 100% mẫu chịu ảnh hưởng của ppt lá úa vàng vàng rụng ở ngày thứ 7 trên SIM2, ở nồng độ 7 mg/l các cụm chồi chết khô hoàn toàn tại ngày thứ 8. Tuy nhiên, tỉ lệ tạo chồi xanh và chồi kéo dài giảm theo sự tăng nồng độ của ppt. Ở nồng độ (3; 5) mg/l ppt hai chỉ tiêu này giảm đi rõ rệt. Sau khoảng 30 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung ppt, đã có sự khác biệt về sinh trưởng của chồi trên các môi trường bổ sung các nồng độ ppt khác nhau. Các môi trường bổ sung nồng độ ppt 3 mg/l, chồi vẫn sinh trưởng phát triển nhưng chậm, có tạo cụm chồi mới xanh. Nồng độ ppt 5 mg/l tỉ lệ cụm đa chồi chết hoàn toàn, kết quả theo (Hình 3.8). Như vậy, từ các kết quả này chúng tôi lựa chọn môi trường bổ sung ppt 3mg/l để chọn lọc cây chuyển gen.
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ ppt đến khả năng tạo chồi
Hình 3.8 Các mảnh lá mầm trên môi trường chọn lọc với nồng độ ppt khác nhau
A: 3mg/l ppt; B: 5mg/l ppt; C: 7mg/l ppt
3.3.3. Kết quả chuyển cấu trúc pIBTII-rd29A-codA vào đậu tương
Giống đậu tương tiến hành nghiên cứu là giống ĐT22 được chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens có chứa vector pIBTII-rd29A-codA. Kết quả thu được trình bày theo (Bảng 3.5). Nồng độ ppt mg/l Số mảnh lá mầm thí nghiệm Môi trường chọn lọc Số mảnh lá trên mt SIM1 Số cụm chồi trên mt SIM2 Số cụm chồi trên mt SEM 0 100 82 82 78 1 100 83 45 38 3 100 86 23 16 5 100 79 16 0 7 100 81 0 0
Bảng 3.5. Kết quả biến nạp vector chuyển gen vào mảnh lá mầm đậu tương
Lô thí nghiệm
Số mẫu
biến nạp Số mẫu tạo đa chồi Số mẫu kéo dài
Số chồi tạo
rễ Số cây sống trên giá thể
1 298 182 11 5 1 2 318 219 14 6 2 3 282 261 11 7 1 4 326 197 13 6 2 5 314 279 22 11 3 6 278 262 12 4 3 7 304 211 16 5 4 8 316 206 12 8 2 9 301 192 14 5 2 10 288 216 15 12 3 Tổng 3025 2225 140 69 23
Số lượng mẫu biến nạp là 3025 trong đó 2225 mẫu tạo đa chồi, chiếm tỉ lệ 73,55%. Từ các cụm chồi này thu được 140 chồi kéo dài ở các giai đoạn khác nhau; có thể ở giai đoạn kéo dài chồi SEM lần 1, lần 2 hoặc lần 3; chiếm tỷ 4,63%. Các chồi mọc cao đến một kích thước nhất định 2,5 – 3,5 cm và đã có các lá chính, cắt sang môi trường tạo rễ chứa kháng sinh cefotaxim 250mg/l. Trong môi trường tạo rễ RM, các chồi ra rễ là 69 chồi. Chất lượng rễ ở các chồi là khác nhau, có những chồi không ra rễ. Chọn lọc các chồi ra rễ tạo cây hoàn chỉnh, tiến hành trồng cây này trong giá thể TN1 bổ sung 25% chibat có 23 cây sống sót và phát triển bình thường khi đặt trong buồng sinh trưởng nhiệt độ 28oC, Độ ẩm 80%, ánh sáng: 16h/8h (sáng/tối). Các giai đoạn phát triển cụ thể được trình bày trong (Hình 3.9).
3.4. PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC DÒNG ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN 3.4.1. Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T0, T1 chuyển cấu trúc rd29A - codA 3.4.1. Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T0, T1 chuyển cấu trúc rd29A - codA
bằng phản ứng PCR
Khi cây được trồng ra giá thể TN1 trong buồng sinh trưởng sau 30 ngày tiến hành thu mẫu lá tách DNA tổng số để kiểm tra bước đầu cây chuyển gen.
Hình 3.10 Kết quả kiểm tra cây T0 bằng PCR
M: thang DNA chuẩn 1kb; +: khuẩn Agrobacterium mang gen cần chuyển; 1-16 các dòng đậu tương T0 chuyển gen; WT: lá cây đậu tương ĐT22
Từ 23 dòng thu được đem đi tách DNA tổng số để kiểm tra ban đầu kết quả chuyển gen. Kết quả tách chiết DNA tổng số thu được một năng lớn không hề đứt gãy phù hợp dùng để tiếp tục phân tích. Từ lượng DNA tổng số, tiến hành phản ứng PCR với 2 cặp mồi codA F/R và Bar F/R. Thu được 9 dòng cho kết quả dương tính với PCR (Hình 3.10) nhận được 2 băng có kích thước là 750bp và 400bp phù hợp với kích thước của đoạn gen Bar và gen codA.
Thu được 20 cây T1 từ hạt 10 dòng đậu tương T0, sau 20 ngày gieo thu mẫu lá tách DNA để kiểm tra kết quả chuyển gen. Tiến hành phản ứng PCR với 2 cặp mồi
nhận được 2 băng có kích thước khoảng 750bp và 400bp phù hợp với kích thước của đoạn gen bar và gen codA.
Hình 3.11 Kết quả kiểm tra cây T1 bằng PCR
M: thang DNA chuẩn 1kb; +: khuẩn Agrobacterium mang gen cần chuyển; 1-4 các dòng đậu tương T1 chuyển gen.
3.4.2. Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T0 và T1 chuyển cấu trúc rd29A-
codA bằng ppt
Phosphinothricin 250mg/l bổ sung tween 20, dùng tăm bông thấm thuốc thử phết trực tiếp lên bề mặt của lá của cây đậu tương đã biến nạp. Thu kết quả sau 3 -5 ngày.
Hình 3.12 Kết quả kiểm tra các dòng Đậu Tương T0 bằng Phosphinothricin
A: Cây T0 dương tính Phosphinothricin 250mg/l B: Cây T0 âm tính Phosphinothricin 250mg/l C: Cây đối chứng
Hình 3.13 Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T1 bằng Phosphinothricin
A: Cây T1gieo sau 20 ngày
B1: Lá cây T1 dương tính Phosphinothricin 250mg/l
B2: Lá cây T1 có khả năng tự phục hồi với Phosphinothricin 250mg/l
B3: Lá cây T1 âm tính Phosphinothricin 250mg/l.
Từ 23 dòng đậu tương T0 thử trực tiếp với Phosphinothricin 250mg/l tại bề mặt lá. Sau 3 ngày phết thuốc diệt cỏ tại vị trí dùng thuốc thử ở 13 cây lá co lại và mất dần sắc tố xanh lục cả lá mà chuyển sang màu xanh vàng đến 5 ngày thì tại vị trí thử chuyển sang màu vàng, cháy khô. 10 cây còn lại tại vị trí thử lá vẫn nguyên hiện trạng ban đầu hoặc lá hơi co lại nhưng không bị mất màu xanh lục của lá. Như vậy kết quả kiểm tra các dòng T0, thu được 10 dòng dương tính với Phosphinothricin 250mg/l.
Sau khi thu hoạch hạt của các dòng T0 tiến hành gieo để đánh giá các dòng T1. Các cây T1 sau khi nảy mầm 22-25 ngày ta dùng Phosphinothricin 250mg/l bổ sung Tween 20 để kiểm tra khả năng kháng thuốc của các cây T1.
Bảng 3.6 Kết quả kiểm tra các dòng T1 bằng Phosphinothricin 250mg/l
-: Kết quả âm tính; +: Kết quả dương tính; ?: Kết quả có khả năng phục hồi với ppt
Số dòng cây Đậu tương T1 (Giống đậu tương DT22)
T0 T1
STT Tên dòng PCR ppt Tên dòng ppt PCR
1 rd29A codA 1 - + + rd29A codA 1.1 - - - - rd29A codA 1.2 - - - - 2 rd29A codA 2 + + + + rd29A codA 2.1 - - - - 3 rd29A codA 3 + - + + rd29A codA 3 + + + + 4 rd29A codA 4 + + + rd29A codA 4.1 - - - - rd29A codA 4.2 + + + + 5 rd29A codA 5 + + + rd29A codA 5.1 - + - - rd29A codA 5.2 + - ? - rd29A codA 5.3 - - - - 6 rd29A codA 6 + + + + rd29A codA 6.1 - - - - rd29A codA 6.2 - - - - rd29A codA 6.3 - - - - 7 rd29A codA 7 + + + + rd29A codA 7.1 - - - - rd29A codA 7.2 - - - - 8 rd29A codA 8 + + + + rd29A codA 8.1 - - - - rd29A codA 8.2 - - - - 9 rd29A codA 9 + + + + rd29A codA 9 + + + + 10 rd29A codA 10 + + + rd29A codA 10.1 - - + + rd29A codA 10.2 - - - - Kết quả sau 5 ngày kiểm tra thu được 3 dòng dương tính hoàn toàn với thuốc thử và 3 dòng có hiện tượng bị ảnh hưởng nhẹ và hồi phục lại trạng thái ban đầu tại vị trí thử, còn lại 13 dòng thì âm tính hoàn toàn với thuốc thử theo Hình 3.13.
3.4.3. Kết quả xây dựng đường xử lý hạn ở giống đậu tương DT22
Mục đích phục vụ cho kiểm tra hoạt động của vector pIBTII-rd29A-codA ở cây đậu tương chuyển gen. Tiến hành xác định ngưỡng chịu hạn của giống đậu tương ĐT22 này trong điều kiện gây hạn nhân tạo.
Hạt giống đậu tương ĐT22 gieo sau 10 - 12 ngày cây đạt lá V3, cây cao từ 28 cm- 30 cm thì sử dụng cho thí nghiệm. Thí nghiệm được thực hiện trong 15 ngày gây hạn nhân tạo. Đến ngày thứ 12 gây hạn nhân tạo gây chết khô hoàn toàn ở giống đậu
độ: 28oC, độ ẩm: 80%, ánh sáng: 14h/10h sáng tối, bổ sung 10ml nước/cây /ngày vẫn sống và phát triển bình thường.
Hình 3.14 Sinh trưởng của giống DT22 sau 3,6,9,12 thí nghiệm
Sự phát triển thân rễ tại buồng xử lý khô hạn và buồng không xử lý có sự khác biệt, kích thước thân của cây không xử lý khô hạn tăng theo đường tuyến tính đi lên, cây xử lý hạn bắt đầu từ ngày thứ 6 thì dừng sinh trưởng về chiều cao thân. Tại ngày thứ 7 thì sự hình thành lá mới không còn ở cây đặt trong buồng xử lý hạn, kích thước lá co ngắn lại, lá chuyển sang màu xanh lục, lớp lông trên bề mặt lá không còn.
Bộ rễ của cây xử lý khô hạn giảm phát triển từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 9 nhưng tăng trở lại sau ngày thứ 9 -12 khi thân cây ngừng phát triển. Sau 6 ngày đặt trong buồng sinh trưởng bộ rễ tại buồng không xử lý hạn cho bộ rễ to rộng nhiều rễ phụ rễ chính phát triển bình thường, tại buồng xử lý hạn thì chỉ thấy rễ chính phát triển theo chiều kéo dài, kích thước giảm ở các ngày tiếp theo.
Bảng 3.7 Sự phát triển của thân và rễ các cây đậu tương ĐT22 thí nghiệm
Chiều cao thân (cm) chiều dài rễ (cm)
Đk Bình thường Đk hạn nhân tạo Đk Bình thường Đk hạn nhân tạo
3 Ngày 33.83 33.63 25.50 20.33
6 Ngày 43.00 41.83 22.92 19.38
9 Ngày 50.83 37.83 29.00 17.50
12 Ngày 59.33 37.83 24.83 19.25
Hình 3.16 Các cây được phục hồi sau 3, 6, 9,10, 11 ngày gây hạn nhân tạo
Các cây được xử lý hạn sau 3, 6, 9, 10, 11, 12 ngày sẽ được chuyển sang buồng sinh trưởng không xử lý hạn để tiến hành phục hồi. Theo Hình 3.16, ta quan sát thấy các cây sau 3 và 6 ngày gây hạn phục hồi phát triển tốt, hình thái cây và thời gian ra hoa đậu quả hoàn toàn kịp với các cây không xử lý hạn. Các cây sau 9 ngày và 10 ngày gây hạn sinh trưởng và phát triển chậm hơn, thân cây bé và ra hoa đậu quả muộn hơn số lượng quả kém. Cây sau 11 ngày xử lý hạn cây vẫn sống và phát triển lá mới nhưng không tạo hoa và đậu quả cùng thời điểm với các dòng xử lý chịu hạn và khả năng thu được nhiều hạt giảm. Vậy các yếu tố hạn hán ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh trưởng phát triển của giống đậu tương DT22, giới hạn sống của giống đậu tương DT22 trong điều kiện xử lý khô hạn nhiệt độ: 33oC, độ ẩm: 55%, ánh sáng: 14h/10h sáng/tối, không bổ sung nước là 12 ngày, sau 9 ngày gây hạn thì cây sinh trưởng và phát triển chậm. Không tạo quả kịp sau 11 ngày gây hạn, ngừng phát triển không phục hồi được sau 12 ngày gây hạn.
gen đích ở mức độ mRNA, protein và sự gia tăng tích luỹ hàm lượng glycine betain ở các dòng đậu tương chuyển gen chịu hạn trong các điều kiện thí nghiệm gây hạn nhân tạo sau 9-12 ngày gây hạn.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1. Đã thiết kế thành công vector chuyển gen pIBTII-rd29A-codA. Trong đó promoter cảm ứng khô hạn điều khiển hoạt động của gen codA.
2. Đã biến nạp thành công vector chuyển gen mang gen codA vào giống thuốc lá K326 thu được 19 dòng, trong đó có 12 dòng xuất hiện băng vạch có kích thước của đoạn gen codA và gen bar trong phản ứng PCR với 2 cặp mồi codA F/R và Bar F/R. Kết quả xử lý hạn và định lượng GB đã chứng minh được các dòng thuốc lá chuyển gen có khả năng chịu hạn nhân tạo cao hơn so với cây đối chứng không chuyển gen.
3. Đã biến nạp thành công vector chuyển gen mang gen codA vào giống đậu tương ĐT22 thu được 23 dòng T0, trong đó có 10 dòng dương tính với thuốc diệt cỏ 250mg/l và 9 dòng xuất hiện băng vạch có kích thước của đoạn gen codA và gen bar trong phản ứng PCR với 2 cặp mồi CodA F/R và Bar F/R. Bước đầu đánh giá và kiểm tra các dòng T1 chuyển gen codA bằng phản ứng PCR và thuốc diệt cỏ 250mg/l, thu được 4 các dòng dương tính với PCR và thuốc diệt cỏ.
4. Xác định được chỉ tiêu liên quan đến tính chống chịu của cây với strees môi
trường: độ dài rễ, trọng lương tươi, trọng lượng khô từ đó xây dựng được phương pháp đánh giá các dòng chuyển gen chịu hạn trong điều kiện phòng thí nghiệm.
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục đánh giá và kiểm tra các dòng đậu tương T1, T2 và các thế hệ sau bằng thuốc diệt cỏ và phản ứng PCR với 2 cặp mồi codA F/R và Bar F/R.
2. Xác định sự có mặt và gắn kết ổn định của gen chuyển trong các dòng đậu
tương chuyển gen bằng Southern blot và đánh giá biểu hiện gen ở mức độ phiên mã và biểu hiện protein đích dưới điều kiện xử lý hạn.
3. Định lượng hàm lượng GB ở các dòng đậu tương chuyển gen, xác định khả
năng hoạt động của gen codA điều khiển bởi promoter cảm ứng khô hạn rd29A.
4. Đánh giá kiểm tra các cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T1 trong điều kiện xử
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Trần Văn Điền. Giáo Trình Cây Đậu Tương. nhà xuất bản nông nghiệp, 2007. 2. Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Nguyễn Hữu Kiên, Dương Tuấn Bảo,
(2013) “Nghiên cứu biến nạp gene liên quan dến khả năng kháng hạn và kháng thuốc trừ cỏ vào giống đậu tương ĐT22.” Tạp Chí KHCN. Bộ NNPTNT, vol. 1.