Vùng ITS (Internal Transcribed Spacers) là một vùng mã hóa cho một đoạn ARN không đóng vai trò chức năng nằm trong vùng mã hóa cho các ARN ribosome nhân. Vùng ITS dài khoảng 655 bp gồm ba phần: vùng ITS1
nằm giữa vùng 18S và 5,8S có kích thước khoảng 255-261 bp, vùng 5,8S dài khoảng 164 bp và vùng ITS2 nằm giữa vùng 5,8S và 28S khoảng 216 - 233 bp.
Đây cũng là trình tự thường xuyên được sử dụng trong nghiên cứu hệ thống phát sinh loài thực vật
Từ kết quả xác định trình tự, chúng tôi tiến hành so sánh mức độ tương đồng của vùng ITS ở mẫu sói rừng nghiên cứu với những kết quả đã công bố trên ngân hàng gen thế giới - NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Kết quả xác định và so sánh trình tự được trình bày ở bảng 3.3 và hình 3.10.
Kết quả xác định trình tự thu được đoạn gen khoảng 650 bp, đúng với kích thước tính toán lý thuyết của vùng ITS là khoảng 655 bp, so sánh trình tự DNA vùng gen ITS của mẫu nghiên cứu với 4 trình tự DNA vùng gen ITS của các loài thuộc chi Sacandra đã được công bố trên Genbank bằng phần mềm Bioedit kết quả cho thấy có tỷ lệ tương đồng cao giữa mẫu ITS chúng tôi phân lập và các trình tự trên Genbank. Vùng ITS của mẫu cây sói rừng nghiên cứu tương đồng 99% so với vùng ITS mã số JN407442, JN407443, KC840060, KP317601 trên ngân hàng gen quốc tế. Kết quả đã khẳng định đoạn gen phân lập từ mẫu sói rừng ở trên là vùng ITS. Như vậy chúng tôi đã nhân bản và xác định được trình tự đoạn vùng ITS phân lập từ mẫu Sói rừng từ Lạng Sơn.
Bảng 3.3. Mức độ tương đồng của vùng ITS của mẫu sói rừng nghiên cứu với một số trình tự trên ngân hàng gen thế giới (NCBI)
STT Trình tự tương đồng với ITS
Mã số trên NCBI Tỷ lệ tương đồng (%) 1
Sarcandra glabra isolate shawpc0691I 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence
JN407442 99
2
Sarcandra glabra isolate shawpc0692I 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence
JN407443 99
3
Sarcandra glabra subsp. brachystachys voucher KUN 200653 internal transcribed spacer 1, partial sequence; and 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence
KC840060 99
4
Sarcandra glabra voucher KWNU91871 internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal transcribed spacer 2, partial sequence
Hình 3.10. Trình tự nucleotide của vùng ITS phân lập từ mẫu sói rừng SR và 4 trình tự mang mã số JN407442,JN407443,KC840060,KP317601 trên
ngân hàng gen quốc tế
Kết quả so sánh trình tự đoạn vùng ITS phân lập từ mẫu cây sói rừng với 4 trình tự trên Genbank có độ tương đồng giao động từ 99,1 đến 99,4. Sự sai khác giao động từ 0,6 – 0,8. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.5.
Mặc dù có hệ số tương đồng tương đối cao, nhưng trong trình tự nucleotide của vùng ITS phân lập từ mẫu Sói rừng vẫn có sự sai khác so với trình tự mang mã số JN407442, JN407443, KP317601 ở 4 vị trí, và sai khác so với trình tự mang mã số KC840060 ở 5 vị trí. Các vị trí sai khác của trình tự nucleotide mẫu SR so với 4 mẫu JN407442, JN407443, KC840060, KP317601 trên Genbank được thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Các vị trí sai khác giữa trình tự nucleotide của vùng ITS
Vị trí các điểm sai khác
Trình tự nucleotide của gen ITS của loài có mã số JN407442 JN407443 KC840060 KP317601 SR. ITS 6 C C T C C 66 G G G G C 102 C C C C T 215 G G G G A 375 C C C C T
Bảng 3.5. Hệ số tương đồng và hệ số sai khác về trình tự nucleotide của vùng ITS phân lập từ mẫu sói rừng thu tại Lạng Sơn
Hình 3.11. Sơ đồ hình cây so sánh mức độ tương đồng đoạn vùng gen ITS của mẫu sói rừng với mẫu có mã số JN407442, JN407443, KC840060, KP317601
H ệ số p h ân ly
Sơ đồ hình cây ở hình 3.11 dựa trên kết quả so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen ITS cho thấy 5 mẫu sói rừng được chia thành 2 nhóm chính. Nhóm thứ nhất gồm các mẫu có mã số JN407442, JN407443, KC840060, KP317601 và nhóm thứ 2 là mẫu Sói rừng. Khoảng cách di truyền giữa hai nhánh là 0,3%.
Như vậy dựa vào phương pháp so sánh trình tự ITS, đã góp phần khẳng định thêm vùng gen ITS là một mã vạch DNA tiềm năng cho nhận diện loài.
Sử dụng mã vạch DNA có vai trò quan trọng trong việc nhận diện các mẫu thực vật, đặc biệt trong nhân diện các loài thực vật dùng làm thuốc thảo dược, giúp đảm bảo về chất lượng sản phẩm và có tầm quan trọng trong việc nghiên cứu các đặc tính của sự đa dạng di truyền. Trong nhiều nghiên cứu trước đây cũng đã chứng minh trình tự ITS và rpoC1 có vai trò to lớn trong việc nhận diện nguyên liệu thảo mộc. Chúng tôi đã bước đầu nghiên cứu sử dụng hai trình tự gen ITS và rpoC1 làm mã vạch DNA. Kết quả giải trình tự và phân tích kết quả thu được cho thấy mẫu nghiên cứu có độ tương đồng tương đối cao với các trình tự được công bố trên Genbank. Cùng với các nghiên cứu khác trên thế giới khẳng định vùng gen ITS và rpoC1 có thể giúp nhận diện loài như một mã vạch phân tử .
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I. Kết luận
1.Đã nghiên cứu đươc một số đặc điểm hình thái của cây sói rừng. Cây thân bụi, có bộ rễ phát triển, cây thân gỗ, lá mọc đối, bông kép, có nhánh ngắn, quả nhỏ và mọng.
2. Đã tách chiết và tinh sạch được DNA tổng số của mẫu sói rừng từ Lạng Sơn. Nhân bản thành công hai vùng gen ITS và rpoC1 bằng phương pháp PCR và tạo dòng thành công hai gen nhân bản được.
3.Đã xác định được trình tự nucleotide của 2 đoạn gen rpoC1 và ITS, kết quả phân tích cho thấy vùng ITS có kích thước khoảng 650 bp và đoạn gen rpoC1 có kích thước 550 bp. Có hệ số tương đồng cao với các trình tự trên ngân hàng gen thế giới, từ 97,6 % - 98,4 % với gen rpoC1; Còn với vùng ITS, hệ số tương đồng từ 99,1 - 99,4 %. Khoảng cách di truyền giữa mẫu sói rừng thu thập tại Lạng sơn và các mẫu trên Genbank dao động từ 0,3 - 1,0.
II. Kiến nghị
Cần tiếp tục phân tích trình tự ncleotide của các gen phân loại khác như
matK, ycf5, trnH-psbA,….. là cở sở phục vụ xây dựng mã vạch DNA cho cây sói rừng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt
[1] Cục Quản lý Dược (2005), Báo cáo tổng kết công tác dược 2000-2005. [2] Nguyễn Quỳnh Anh (2013), “ Nghiên cứu ứng dụng cây Sói rừng (
Sarcandra GlaBra (Thunb) Nakai) ở Cao Bằng để hỗ trợ điều trị một số bệnh ung thư”, Khoa học và công nghệ Cao Bằng
[3] Đái Duy Ban và Lữ Thị Cẩm Vân và cs (2000). Phòng bênh ung thư. Nhà xuất bản Y học Hà Nội, 150-155.
[4] Võ Văn Chi, Từ điển thực vật thông dụng, Nxb Khoa học kỹ thuật, tập 2, 2004.
[5] Võ Văn Chi (1999), Từ điền cây thuốc Việt Nam, NXB Y học
[6] Vũ Văn Chuyên, Tóm tắt đặc điểm các họ cây thuốc Việt Nam, Nxb Y học Hà Nội, 1976.
[7] Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, Nxb trẻ, quyển 1, tr 287, 1999.
[8] Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng, (2008), Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội.
[9] Nguyễn Hải Nam (2012). Một số mục tiêu phân tử và ứng dụng trong nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung thư hiện nay. Nhà xuất bản Y học Hà Nội, 18-25.
[10] Bùi Văn Trọng, Nguyễn Cao Xuân Viên, Nguyễn Thanh Nguyên, (2014), “Ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng tới sự hình thành rễ của hom cây sói rừng ( Sarcandra Glaban (Thunb.) Nakai.) tại Lâm Đồng ”, Tạp chí Viện dược liệu Hà Nội, tập 19, số 6.
[11] Viện Dược Liệu (1973), Sổ tay cây thuốc Việt Nam. NXB Y học, tr 213. [12] Mai Thị Hải Yến (2010), “Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác
dụng sinh học của cây Sói rừng”, Luận văn thạc sỹ dược học, Học viện quân y.
Tài liệu tiếng nước ngoài
[13] Alvarez I., Wendel J.F. (2003), “Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference”, Molecular Phylogenetics and Evolution, 29,pp.417-434.
[14] Hamilton B.M. (1999), “Four primer pairs for the amplification of chloroplast intergenic regions with intraspecific variation”, Molecular Ecology, 8,pp.513-525.
[15] Borsch T., Hilu K.W., Quandt D., Wilde V., Neinhuis C., Barthlott W. (2003), “Noncoding plastid trnT-trnF sequences reveal a well resolved phylogeny of basal angiosperms”, Journal of Evolutionary Biology, (6), pp. 558-576.
[16] Chase M. W., Nicolas S., Mike W., James M. D., Rao P. K., Nadia H., and Vincent S. (2005), “Land plants and DNA barcodes: short-term and long-term goals”, Philosophical Transactions of the Royal Society, 360 (1462), pp. 1889-1895.
[17] Collons G.G. and Symons R.H. (1992), Plant Molecular Biology Reporter., 10,233. [18] Feng S., Xu L., Wu M., Hao J., Qiu SX, Wei X., (2010), A new curmarin
from Sarcandra Glabra, Fitoterapia,.
[19] Huang M.J., Zeng G.Y., Tan J.B., Li Y.L., Jan G.S., Zhou Y.J. (2008),
Studies on flavonoid glycosides from Sarcandra Glabra, Zhongguo zhong yao za zahi, Vol 33(44), p 1700 – 10702.
[20] Huang D., Huang H., Lu Y., (2013), Clinical Observation of Sarcandra glabra combined chemoradiotherapy for treating patients with local advanced nasopharyngeal carcinoma. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie Za Zhi, 33(4), 456-458.
[21] Hu X., Xu X., Yang J., (2008), Progree in research on Sarcandra Glabra.
[22] Hebert P.D.N, Cywinska A., Ball S.L., De Waard J.R., (2003), “Biological indentification through DNA barcodes”, Proc R Soc Lond B Biol Sci, 270,pp.313-321.
[23] He R.R., Yao X.S., Li H.Y., Dai Y., Duan Y.H., Li Y.F., Kurihara H., (2009), The anti-stress effects of Sarcandra glabra extract on restraint- evoked immunocompromise, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 32(2), 247-252.
[24] Jarman S.N., Elliott N.G., (2000), “DNA evidence for morphological an cryptic Cenozoic speciations in the Anaspididae, “living fossils” From the Triassic”, Journal of Evolutionary Biology., 13,pp.624-633.
[25] Kesanakurthi R.P., Fazekas A.J., Burgess K.S., Percy D.M., Newmaster S.G., Graham S.W., Barrett S.C., Hajibabaei M., Husband B.C., (2011), “Spatial patterns of plant diversity below ground as revealed by DNA barcoding”, Molecular Ecology, 20, pp.1289-1302.
[26] Kress J.W., Wurdack K.J., Zimmer E.A., Weigt L.A.,Janzen D.H., (2005), “Use of DNA barcodes to identify flowering plants”, Proc.Natl Acad.Sci USA, 102,pp.8369-8374.
[27] Kress W. J., Erickson D. L., (2008), “DNA barcodes: Genes, genomics, and bioinformatics”, Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8), pp. 2761-2762. [28] Kang M., Tang A.Z., Liang G., Yi X., Liu J., (2008), Study on the
apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cell line administrated with Sarcandra glabra extracts in vivo and its mechanism. Zhong Yao Cai. Vol.31 (10):1529-1533.
[29] Leng Y., Li G., Chen S., (2010), Research related to the effectiveness of anti tumor effect of Herba Sarcandra. Chin J Mod Drug App, l 4, (6), 16-20 [30] Ole S., Gitte P., (2009), “How many loci does it take to DNA barcode a
crocus?”, PLoS ONE, 4(2), pp. 4598.
[31] Paul D.N. Hebert, Alina C., Shelley L.B., Jeremy R.W., (2003), “Biological identifications through DNA barcodes”. Proc.R.Soc.Lond.B
[32] Porebski S., Baily L.G., Baum B.R., (1997), Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 8-15. [33] Ratnasingham S., Paul D.N. Hebert , (2007), “BOLD: the barcode of life
data system”, Molecular Ecology Resources, 7, pp.355-364.
[34] Savolainen V., Chase M. W., (2003), “A decade of progress in plant molecular phylogenetics”, Trends Genet, (19), pp. 717-724.
[35] Shaw J., Lickey E.B., Schilling E. E., Small R.L., (2007),” Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms”, The tortoise and the hare III. Amer. J. Bot, (94), pp. 275-288.
[36] Song J.Y., Yao H., Li Y., Li X.W., Lin Y.L, Liu C., Han J., Xie C., Chen S., (2009), Authentication of the family Polygonaceae in Chinese pharmacopoeia by DNA barcoding technique. J Ethnopharm 124: 434–439.
[37] Storchova H., Olson M. S., (2007), “The architecture of the chloroplast psbA-trnH non coding region in angiosperms”. Plant systematic and evolution. Biomedical and life Sciences, Vol 268, No 1-4, pp. 235-256. [38] Sun W., Li J., Lan F., (2014), “Antitumor activities of Zhongjiefeng
injection on FC in mice with precarcinoma of stomach and its toxicity”,
Chinese Traditional Patent Medicine Journal , (3), 169-171.
[39] Taberlet P., Eric C., François P., Ludovic G., Christian M., Alice V., Thierry V., Gérard C., Christian B., Eske W., (2007), “Power and limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding”, Nucleic Acids Res, 35(3), pp14.
[40] 徐国良,肖兵华,陈奇(2005),肿节风及其分离部位对免疫性血小板 减
Từ Quốc Lượng, Tiêu Tân Hoa, Trần Kỳ (2005). Tác dụng của thũng tiết phong và thành phần của thuốc tới tiểu cầu chuột xuất huyết giảm tiểu cầu. Tạp chí thực nghiệm Trung Quốc, 11(4),120-124.
[41] Van den Berg C., Higgins W. E., Dressler R. L., Whitten W. M., Soto Arenas M. A., Culham A., Chase M. W., (2000), “A phylogenetic analysis of Laeliinae (Orchidaceae) based on sequence data from nuclear internal transcribed spacers (ITS) of ribosomal DNA”, Lindleyana (15), pp.96114 [42] Van DeWiel C. C. M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J. L.,
Duistermaat C. H., Smulders ,(2009), “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”, Molecular Ecology Resources (9), pp.1086-1091.
[43] Vijayan K., Tsou C. H., (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective”, Current science, vol. 99, pp. 1530 - 1540.
[44] Wang X., T.Y., Yoshimaru H., Nagasaka K., Szmidt A.E., (1999), “Phylogenetic relationships of Eurasian pines (pinut, Pinaceae) based on chloroplast rbcL, matK, rpl120-rps18 spacer, and trnV intron sequences”, American Journal of Botany 86,pp.1742-1753.
[45] Wang W., Wu Y., Yan Y., Ermakova M., Kerstetter R. (2010), “DNA barcoding of the Lemnaceae, a family of aquatic monocots”, BMC Plant Biology (10), pp.205.
[46] Wang A.Q., Feng S.C., He X., Xu R.S.,. (1988), A new sesquiterpen lactone from Sarcandra Glabra, Yao xue xue bao, Vol 23 (1): 64 – 66,. [47] Wen J., Li J., Lan F., Yan G.. (2003), “Antitumor effect of
Zhongjiefeng Injection on mice liver cancer HepA22 and its toxicity”.
Chinese Traditional Patent Medicine Journal, 4, 39-43.
[48] Wu F., Mueller L. A., Crouzillat D., Petiard V., Tanksley S. D. (2006), “Combining bioinformatics and phylogenetics to identify large sets of
single-copy orthologous genes (COSII) for comparative, evolutionary and systematic studies: A test case in the euasterid plant clade”, Genetics (174), pp. 1407-1420.
[49] Xu X.D., Hu X.R., Yuan J.Q., Yang J.S., (2008), Studies on chemical constituents of Sarcandra glabra, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. Vol. 33(8): 900-902.
[50] Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J., (2010), “Use of ITS2 region as theuniversal DNA barcode for plants and animals”, PLoS ONE (5), pp.13102.
[51] Yong H. L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L., Hui Y. (2010), “Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique”,
Journal of Medicinal Plants Research Vol. 4(24), pp. 2706-2709.
[52] Yuan K., Zhu J.X., Si J.P., Cai H.K., Ding X.D., Pan Y.J. (2008), Studies on chemical constituents and antibacterial activity from n-butanol extract of Sarcandra glabra. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. Vol. 33: 1843-1846. [53] Zhang Z., Liu W., Zheng Y., Jin L., Yao W., Gao X., (2014), SGP-2, an
acidic polysaccharidee from Sarcandra Glabra inhibits proliferation and migration of human osteosarcoma cell. Food Funct, 5, 16