2.2.2.1.Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Bảng 2.2. Thành phần dung dịch đệm rửa
STT Hóa chất Nồng độ chuẩn Nồng độ cuối cùng
1 Sorbitol 350 mM
2 Tris-HCl (pH 8,0) 1 M 100 mM
3 EDTA (pH 8,0) 0,5 M 5 mM
4 Sordium metabisulfit 5%
Bảng 2.3. Thành phần dung dịch đệm tách
STT Hóa chất Nồng độ chuẩn Nồng độ cuối cùng
1 NaCl 3 M 1.5 M
2 Tris-HCl (pH 8,0) 1 M 100 mM
3 EDTA (pH 8,0) 0,5 M 20 mM
DNA được tách chiết bằng phương pháp CTAB có cải tiến bao gồm các bước sau.
1. Ngiền nhanh 0,2g lá bằng cối chày sứ trong nitơ lỏng cho đến khi tạo thành bột thật mịn, sau đó chuyển ngay vào ống Eppendorf 2ml, giữ trong đá. 2.Bổ sung 1ml đệm rửa, lắc mạnh trong 40 giây, ly tâm 12000 vòng/phút,
4oC, 7 phút
3. Loại bỏ dịch nổi và lặp lại từ 2 - 3 lần
4. Bổ sung 800 µl đệm chiết, lắc đều và giữ ở 65oC trong thời gian 30 phút đến 1giờ
5. Giữ mẫu ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10 phút
6. Bổ sung 800 µl chloroform : isoamyl alcohol (24:1) vào mẫu, lắc đều trong thời gian 10 phút
7. Ly tâm với tốc độ 12000 vòng/ phút trong thời gian 15 phút ở 4oC 8. Dùng pipet chuyển dịch nổi sang ống Eppendorf 1,5 ml
9. Bổ sung một thể tích tương đương isopropanol lạnh và đảo nhẹ, giữ mẫu trong đá 30 phút.
10. Ly tâm 12000 vòng/ phút trong thời gian 15 phút ở 4oC
11. Loại bỏ dich nổi, rửa DNA bằng cách thêm 500 µl cồn 80%, ly tâm 12000 vòng/ phút trong thời gian 4 phút ở 4oC ( Bước này thực hiện 2 lần), sau đó đảo nhẹ nhàng lọa bỏ cồn.
12.Làm khô DNA bằng quạt gió 13.Hòa tan trong 100 µl H2O
14.Sau khi DNA được hòa tan hoàn toàn thì bổ sung 3 µl Rnase (10mg/ml). Giữ sản phẩm ở 37oC trong 1 giờ
15.Bảo quản DNA tổng số ở -20oC