Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch, chạy điện di kiểm tra và tính toán hàm lượng DNA để dùng cho phản ứng ghép nối vào vector tách dòng pBT. Phản ứng ghép nối là phản ứng hình thành liên kết phosphodiester giữa base Adenin ở đầu 5’ của sản phẩm PCR với base Thymine ở đầu 3’ của vector tách dòng nhờ hoạt tính nối của enzyme T4 ligase. Nguyên lý và kỹ thuật ghép nối đoạn gen vào vector tách dòng được trình bày cụ thể ở mục
2.2.2.5. Kết quả của phản ứng ghép nối sẽ được thể hiện sau khi biến nạp vào tế bào khả biến E. coli.
Sản phẩm của quá trình chuyển gen vào vector pBT sẽ được biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5α, sau đó được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung carbenicilin 50 mg/l, X-gal 40 µl/ml và IPTG 100μM. Kết quả của quá trình này sẽ là sự xuất hiện của những khuẩn lạc xanh và trắng, trong đó khuẩn lạc trắng là những khuẩn lạc chúng ta quan tâm.
Hình 3.5. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp gen rpoC1 vào tế bào khả biến Tất cả các khuẩn lạc này là những khuẩn lạc đều đã được biến nạp plasmid chứa gen kháng sinh carbenicillin nên có thể phát triển được trên môi trường chọn lọc này và phát triển thành các khuẩn lạc. Những khuẩn lạc xanh xuất hiện là do vector không có nhận được gen ngoại lai. Do vector có mang operon lacZ nên khi operon này hoạt động bình thường và khi có mặt chất
cảm ứng IPTG sẽ tổng hợp enzyme β- galactosidase, enzyme này sẽ chuyển hóa cơ chất X-gal thành hợp chất có màu xanh. Còn những khuẩn lạc trắng là do nhận được plasmid mang gen ngoại lai. Gen ngoại lai sẽ chèn vào và nó sẽ phá vỡ cấu trúc gen lacZ khi có chất cảm ứng IPTG thì gen lacZ cũng không tổng hợp enzyme β- galactosidase và không xảy ra sự chuyển hóa X-gal. Tuy nhiên không phải tất cả các khuẩn lạc trắng đều mang plasmid tái tổ hợp có chứa đoạn gen barcode chèn vào có thể là chứa đoạn gen là sản phẩm phụ của phản ứng PCR, sự đột biến trên promoter lac hay sự đứt gãy base thymine đầu 3’ của vector cũng có thể làm cho khuẩn lạc mang màu trắng. Vì vậy để có thể biết chính xác các khuẩn lạc trắng mang plasmid tái tổ hợp cần tiến hành chọn bằng phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony - PCR) để phục vụ cho quá trình nghiên cứu tiếp theo.
Từ kết quả trên cho thấy quá trình biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến có kết quả tốt. Trên đĩa nuôi cấy xuất hiện những khuẩn lạc xanh và trắng. Trong đó mật độ là số lượng khuẩn lạc trắng tương đối lớn, đủ để tiến hành chọn lọc khuẩn lạc.