Khuếch đại đoạn gen là công đoạn đầu tiên nhằm nhân lên các đoạn DNA chỉ thị mong muốn sử dụng các cặp mồi đặc hiệu. Trong nhiều công bố gần đây về sử dụng DNA barcode, các tác giả cho thấy việc nhân bản thành công các trình tự DNA barcode bằng phản ứng PCR phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng DNA dùng làm khuôn và đặc biệt là nhiệt độ bắt mồi đặc hiệu (Yonghua Li và cộng sự, 2010) [36].
rpoC1 là một trong những gen cơ bản trong việc nghiên cứu sự phát sinh loài, đã được sử dụng ở nhiều nhóm sinh vật khác nhau còn ITS là gen nhân được sử dụng nhiều trong phân tích đa dạng và xác định loài ở thực vật. Để khuếch đại được đoạn gen rpoC1 và ITS chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu như đã trình bày ở bảng 2.4. Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR như ở mục 2.2.2.3.
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm nhân gen rpoC1 (A) và sản phẩm nhân bản vùng ITS (B) từ các cặp mồi đặc hiệu
M. Maker 1kb; 1. Sản phẩm PCR nhân gen
Kết quả nhân bản gen ITS và rpoC1 cây sói rừng ở Hình 3.4 cho thấy vùng ITS có kích thước khoảng 650bp, gen rpoC1 có kích thước khoảng 550bp đúng như kích thước dự đoán ban đầu. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% cho thấy băng vạch sáng rõ nét và chỉ có một băng duy nhất điều này chứng tỏ quá trình nhân bản vùng ITS và gen rpoC1 có kết quả tốt ở mẫu sói rừng nghiên cứu. Do đó, sản phẩm này được chúng tôi sử dụng cho tách dòng và giải trình tự.
Sản phẩm PCR thu được sau phản ứng khuếch đại gen còn có lẫn các tạp chất như mồi, đệm PCR, các nucleotide,... và đôi khi có thể chứa các sản phẩm phụ sẽ ảnh hưởng đến kết quả của quá trình tách dòng, do vậy cần tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR trước khi tiến hành quá trình đưa gen vào vector tách dòng. Việc tinh sạch được thực hiện bằng bộ Kit AccuPrep Gel Purification Kit. Nguyên lý của phản ứng và quy trình thực hiện được nêu ở mục 2.2.2.4. Các đoạn gen sau khi tinh sạch được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra chất lượng và xác định sơ bộ hàm lượng DNA tinh sạch. A B 550 bp 750 500 250 650 bp 750 500 250