Cõy phả hệ xõy dựng dựa trờn trỡnh tự amino acid của 23 chuỗi gen cox1 của cỏc loài thuộc lớp sỏn lỏ Trematoda cú xuất xứ từ Việt Nam, Trung Quốc, Nga, Hàn Quốc, Nhật Bản, Lào, Indonesia và Australia, được trỡnh bày ởhỡnh 3.8.
Kết quả cho thấy, cú 5 nhúm được phõn định thuộc vào cỏc họ: Fasciolidae; Opisthorchiidae; Heterophyidae; Echinostomatidae và Paragonimidae (Hỡnh 3.8):
1- Nhúm thuộc họ Fasciolidae: hai mẫu sỏn lỏ gan lớn Fasciola sp của Việt Nam trong nghiờn cứu là FspCB-VN và FspNB-VN trong đú, cú hai phõn nhúm gồm: i) Mẫu FspCB-VN cựng nhỏnh với FspGHL-CN (dạng lai) của Trung Quốc
[50]; ii) Mẫu FspNB-VN cựng nhỏnh với F. gigantica dạng thuần của Trung Quốc (mẫu Fgig-CN) và Indonesia (Fgig-ID); iii) Mẫu Fhep-AU (F. hepatica, Australia) tạo nờn một nhỏnh riờng biệt.
2- Nhúm thuộc họ Opisthorchiidae, gồm phõn nhúm sỏn lỏ gan nhỏ
Clonorchissinensis (Csin-VN) cựng nhúm với cỏc mẫu của Trung Quốc (Csin- CN); Hàn Quốc (Csin-KR); Nga (Csin-RU) và phõn nhúm Opisthorchis viveriini
(mẫu Oviv-VN, Việt Nam; Oviv-LA, Lào). Mẫu Ofel-RU thuộc loài Opisthorchis felineus tạo thành nhỏnh riờng với cỏc phõn nhúm trờn.
3- Nhúm sỏn lỏ ruột nhỏ thuộc họ Heterophyidae bao gồm Haplorchis taichui (mẫu Việt Nam, Htai-VN và mẫu Lào, Htai-LA) cựng với một mẫu của loài Stellantchasmus falcatus (Sfal-VN).
Hỡnh 3.8. Cõy phả hệ thể hiện mối quan hệ về loài giữa cỏc mẫu sỏn lỏ dựa trờn
thành phần amino acid của gen cox1 bằng chương trỡnh MEGA6. Ký hiệu (●) là mẫu Fasciola được sử dụng trong nghiờn cứu này.
Paragonimidae ( Sỏn lỏ phổi) Echinostomatidae Fasciolidae (Sỏn lỏ gan lớn) Heterophyidae (Sỏn lỏ ruột nhỏ) Opisthorchiidae (Sỏn lỏ gan nhỏ
4- Nhúm cỏc mẫu sỏn lỏ phổi bao gồm Paragonimus heterotremus (Phet- VN) cựng hợp thành một nhúm với P. westermani của Hàn Quốc (mẫu Pwes(2n)- KRvà Pwes(3n)-KR) và P. ohirai (mẫu Pohi-JP) của Nhật Bản, thuộc họ Paragonimidae.
5-Mẫu Ejap-VN của loài Echinochasmus japonicus (họ Echinostomatidae) đứng thành một nhỏnh riờng, nhưng rất gần với cỏc loài thuộc họ Fasciolidae
Sỏn lỏ gan lớn thuộc giống Fasciola ở Việt Nam từ trước đến nay đó được xỏc định là Fasciola gigantica, tuy nhiờn, một số cỏ thể cú hỡnh thỏi giống F. hepatica (F. hepatica – like) trong đú gen ITS-2 của hệ gen nhõn giống với F. hepatica cũn hệ gen ty thể lại giống với F. gigantica, dẫn đến phỏt hiện cú sự lai chộo loài trong tự nhiờn giữa F. hepatica và F. gigantica [46], [47], [55].
Trong nghiờn cứu chỳng tụi cũng đó phỏt hiện mẫu FspCB-VN tại Cao Bằng là mẫu sỏn lỏ gan thuộc dạng lai (hybrid form). Điều này cũng là minh chứng một lần nữa khẳng định trong quần thể sỏn lỏ gan lớn tại Việt Nam chắc chắn đó cú sự hiện diện và tồn tại “nguồn gốc thủy tổ” của F. hepatica từ trước đõy. Cần cú thờm cỏc nghiờn cứu giải trỡnh tự về cỏc gen/toàn bộ hệ gen của con lai để xem xột, phõn tớch về khoảng cỏch di truyền và mức độ tiến húa loài của loài này.
BÀN LUẬN CHUNG
Gen ITS-2: Sử dụng chỉ thị di truyền vựng giao gen ITS-2 cựng với gen
28S (thuộc hệ gen nhõn) và gen cox1 (thuộc hệ gen ty thể) trong thẩm định loài bằng sinh học phõn tử đối với sỏn lỏ gan lớn gõy bệnh ở trõu (FspNB-VN) và bũ (FspCB-VN) đó được thực hiện. Kết quả cho thấy ở cả hai mẫu trong nghiờn cứu cú gen cox1 (ty thể) khụng biến đổi và được di truyền theo dũng mẹ F. gigantica, trong khi đú vựng giao gen ITS-2(nhõn) đó phõn ra hai loại mới: loại trung gian giống như F. gigantica like và loại trung gian giống như F. hepatica like dựa trờn biến đổi cỏc nucleotide ở 7 vị trớ của vựng giao gen ITS-2. Tại vị trớ 327 ở vựng giao gen ITS-2 cú giỏ trị phõn biệt dũng bố và tớnh lai ngoại loài (và lai chộo ngược) giữa F. hepatica và F. gigantica.
Đối với 2 mẫu FspCB-VN và FspNB-VN, khi so sỏnh với cỏc chủng khỏc được phõn lập trờn trõu, bũ, dờ, cừu và người cho thấy: FspNB-VN thuộc F. gigantica, cũn mẫu FspCB-VN thuộc dạng lai giữa (F. gigantica x F. hepatica), kớch thước gen ITS-2 của FspCB-VN là 362 nucleotide và cú thờm nucleotide T (Thymin) ở vị trớ 327. Xột về phõn loại theo hỡnh thỏi học (Hỡnh 3.1.1), sỏn lỏ gan trưởng thành FspCB-VN cú hỡnh dạng giống F.hepatica. Chủng này được kết luận là F.gigantica
lai với F.hepatica, trong đú: F.gigantica thuộc dũng mẹ và F. hepatica thuộc dũng bố. Điều này khẳng định rừ ràng rằng F.hepatica đó xuất hiện trong quần thể sỏn lỏ gan Việt Nam tạo khởi đầu cho tiến húa lai với F. gigantica.
Khi sử dụng ITS-2 xõy dựng cõy phả hệ cũng chia làm hai nhúm: Nhúm thứ nhất là F. gigantica và F. gigantica-like, trong đú gồm cỏc chủng thuần nhất
F.gigantica của Việt Nam và thế giới, nhúm thứ hai là F. hepatica và F. hepatica- like, trong đú cú cỏc chủng thuần nhất và cỏc chủng khụng thuần nhất cú hiện tượng của loài lai (hybrid). Những chủng khụng thuần nhất này cú hệ gen ty thể thuộc loài F. gigantica. Cỏc chủng này mang hệ gen nhõn của loài F. hepatica và hệ gen ty thể của F. gigantica. Mặc dự cú thể chỳng ta chưa biết đó xảy ra bao nhiờu thế hệ lai nhưng rừ ràng đó cú sự tỏi tổ hợp gen nhõn của dũng bố F. hepatica
với hệ gen ty thể của dũng mẹ F. gigantica, và dũng lai này cứ thế lai tiếp với F. gigantica cung cấp ty thể dũng mẹ.
Đối với gen 28S:Một phần gen 28S ribosome (~1000 bp) của 2 mẫu sỏn lỏ
gan lớn Fasciola sp (FspNB-VN và FspCB-VN) đó được giải trỡnh tự và so sỏnh với cỏc gen 28S tương ứng của F. hepatica vàF. gigantica cựng một số loài thuộc họ Fasciolidae,bao gồm:F. jacksoni, Fasciolopsis buski và Fascioloides magna, cú trong Ngõn hàng gen. Phõn tớch phả hệ gen 28S cho thấy:
-Mẫu là FspCB-VN nằm trong nhúm của F. hepatica cựng với mẫu của Equador là FspEQO; mẫu của Ai Cập là FhepEG (số đăng ký: EU025874) và mẫu của Arab Saudi FhepSA (số đăng ký: AY222244); mẫu FhBe (Bỉ); FhAus (Úc) và.
-Mẫu FspNB-VN (F. gigantica) cú quan hệ gần với FgigTH (F. gigantica, số đăng ký: HM004190).
-Việc phỏt hiện FspCB gần với F. hepatica cần được nghiờn cứu thờm để phõn định đặc tớnh và làm sỏng tỏ về loài của mẫu này.
Gen ty thể cox1: Sử dụng đơn thuần một phần của gen ty thể là chuỗi gen
cox1 (~ 1,6 kb) dựa trờn trỡnh tự nucleotide xõy dựng cõy phả hệ cũng được chia làm hai nhúm: một nhúm thuần nhất của F. hepatica và một nhúm bao gồm tất cả cỏc chủng F. gigantica và F. gigantica-like, trong đú cú cỏc chủng của Việt Nam. Điều này chứng tỏ, tất cả cỏc chủng này, bất luận dạng thuần hay dạng lai đều cú hệ gen ty thể thuộc loài F. gigantica di truyền dũng mẹ. Dạng trung gian này xuất hiện ởcảmẫu sỏn thu được trõu, bũ và trờn người. Đõy là một bằng chứng cho dạng gen lai giữa 2 loại sỏn lỏ gan lớn tại Việt Nam cũng như Đụng Nam Á. Điều này, gúp phần giải thớch cơ chế gõy bệnh sỏn lỏ gan lớn trờn người của Việt Nam và Đụng Nam Á cú những nột đặc trưng khụng giống như cỏc vựng khỏc trờn thế giới. Đõy chớnh là một sự đa dạng sinh học và phức tạp của cỏc loài ký sinh trựng truyền lõy từ động vật sang người [2].
Như vậy chứng tỏ đó cú sự tạo dũng lai ngoại loài (introgressive hybridization) hay lai chộo ngược, trong dõn gian cũn gọi là hiện tượng "lại giống"
ở động vật mà một số dũng lai và dũng thuần F. gigantica đều cú khả năng tỡm kiếm thớch ứng và gõy bệnh trờn người.
Lai chộo loài ở Fasciolasp đó được phỏt hiện nhiều nơi trờn thế giới và ghi nhận như một hiện tượng tự nhiờn giữa hai loài F. hepatica và F. gigantica tạo ra dạng trung gian (hybrid form/intermediate forms) [24], [26], [50], [63], [64] và đõy cũng là hiện tượng tiến húa rất phổ biến trong lớp Trematoda với những dẫn chứng cụ thể ở loài sỏn mỏng Schistosoma[36], [59], sỏn lỏ phổi Paragonimus
[30]; hoặc ở cỏc loài sỏn dõy Taenia thuộc lớp Cestoda [57]. Vấn đề là ở chỗ, trong dạng lai giữa hai loài, loài nào cho hệ gen nhõn và loài nào cho hệ gen ty thể.
Đối với Fasciola sp. dạng lai, cho đến nay, hệ gen ty thể của chỳng cú thành phần giống với F. gigantica [26], [47], [55], [63] cũng như khẳng định của kết quả nghiờn cứu sử dụng gen cox1 được trỡnh bày trong nghiờn cứu này.
Lai ngoại loài là hiện tượng tiến húa bất thường chỉ gặp ở lớp sỏn lỏ (Trematoda) núi chung và như vậy kết quả của chỳng tụi cũng đó minh cú dũng lai giữa { F.gigantica (bố)- F.gigantica (mẹ)} trong loài sỏn lỏ gan lớn gõy bệnh trờn gia sỳc (trõu, bũ) ở Việt Nam.
Đõy là vấn đề hiện nay đang cần được cỏc nhà khoa học trong nước và trờn thế giới quan tõm xem xột và cú những nghiờn cứu tiếp theo một cỏch sõu sắc cú hệ thống hơn.
KẾT LUẬN
1) Gen ITS-2 đó được sử dụng làm chỉ thị phõn tử để phõn biệt 2 mẫu Fasciola sp: trong đú mẫu FspNB-VN (Ninh Bỡnh) thuộc Fasciola gigangtica; mẫu FspCB-VN thuộc dạng lai (hybrid form)
2) Gen 28S của 2 mẫu Fasciola.spp thu tại Việt Nam (FspNB-VN và FspCB- VN) đó được giải trỡnh tự và phõn tớch mối quan hệ phả hệ. Chỉ thị phõn tử của gen 28S cũng cho thấy quần thể Fasciola spp tại Việt Nam cú hai nhúm thuộc F. gigantica và F. hepatica, trong đú cú mẫu FspCB-VN cú khả năng thuộc F. hepatica.
3) Gen cox1 của 02 mẫu sỏn lỏ gan lớn FspNB-VN và FspCB-VN đó được giải trỡnh tự. Kớch thước của gen cox1 là 1542 nucleotide, mó húa 513 amino acid.Tỷ lệ tương đồng amino acid gen cox1của Fasciola sp trong cựng một loài cú sự bảo tồn cao từ 97 - 99%.
Sự đa dạng trong quần thể Fasciola sp cần được nghiờn cứu thờm về quan hệ loài nhằm làm sỏng tỏ sỏn lỏ gan lớn gõy bệnh trờn người và động vật để cú biện phỏp phũng chống và điều trị bệnh chớnh xỏc và phự hợp.
KIẾN NGHỊ
Cần tiếp tục giải trỡnh tự toàn bộ hệ gen ty thể của FspCB-VN và thu thập thờm cỏc mẫu sỏn lỏ gan lớn tại Việt Nam trờn cỏc đối tượng vật chủ khỏc nhau để cú thể xỏc định tớnh lai chộo tự nhiờn trong quần thể sỏn lỏ gan lớn và xõy dựng mụ hỡnh tiến húa theo vựng địa lý hoặc địa danh phõn bố ở Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Nguyễn Quốc Doanh, Lờ Thanh Hoà (2006), “Một số đặc điểm hỡnh thỏi và phõn tử của sỏn lỏ gan (Fasciola spp) ở bũ của tỉnh Nghệ An và Cao Bằng”, Tạp chớ Khoa học kỹ thuật Thỳ y, 13(5), tr. 59 - 67.
2. Trần Thanh Dương, Nguyễn Thu Hương, Nguyễn Thị Hương Bỡnh (2013), “Dạng lai trong mẫu sỏn lỏ gan lớn trờn trõu bũ và người tại Quảng Ngói”, Tạp chớ Y học thực hành,(1), tr. 48 - 52.
3. Nguyễn Văn Đề, Lờ Thanh Hoà (2004), “Xỏc định thành phần loài SLGL trờn người Việt Nam từ trứng phõn lập trong phõn người bằng phương phỏp phõn tử hệ gen ty thể”, Tạp chớ Y học thực hành, 463(7), tr. 42 - 46.
4. Nguyễn Văn Đề, Đỗ Tuấn Anh (2011), “Nhiễm sỏn lỏ gan lớn trờn nhúm bệnh nhõn được chẩn đoỏn là “u gan” tại cỏc bệnh viện Hà Nội 2006-2010”, Tạp chớ Y học Thực hành, (8), tr. 169 - 171.
5. Nguyễn Văn Đề (2012), “Cập nhật bệnh ký sinh trựng ở Việt Nam”, Hội nghị khoa học quốc tế Mekong Health III – Kỷ niệm 110 năm thành lập Trường Đại học Y Hà Nội, tr. 9 - 12.
6. Lờ Thanh Hoà, Nguyễn Văn Đề (2002), “Xỏc định SLGL (Fasciola gigantica) ở Việt Nam bằng phương phỏp sinh học phõn tử hệ gen ty thể sử dụng gen nad1
(nicotinamide dehydrogenase subunit 1)”, Tạp chớ phũng chống sốt rột và cỏc bệnh ký sinh trựng, (3), tr. 41 - 48.
7. Lờ Thanh Hũa (2007), “Chỉ thị di truyền phõn tử sử dụng trong giỏm định, chẩn đoỏn, phõn loại, phả hệ, dịch tễ học và di truyền quần thể ký sinh trựng”, Tạp chớ Y học thành phố Hồ Chớ Minh, (11), tr. 9 - 14.
8. Phạm Văn Khuờ và Phan Lục (1996), Ký sinh trựng thỳ y, Nhà xuất bản nụng nghiệp Hà Nội, tr. 53 - 62.
9. Nguyễn Trọng Kim (1997), Nghiờn cứu sự liờn quan đến tỷ lệ nhiễm ấu trựng sỏn lỏ gan ở ốc (KCTG) với tỷ lệ nhiễm sỏn lỏ ở trõu bũ (KCTC) để đỏnh giỏ tỡnh hỡnh
dịch tế của bệnh ở một số vựng miền Bắc Việt Nam, Luận ỏn tiến sỹ nụng nghiệp, Viện khoa học kỹ thuật Việt Nam, Hà Nội.
10. Nguyễn Thị Kim Lan, Nguyễn Quang Tuyờn (1999), Giỏo trỡnh ký sinh trựng thỳ y, Nhà xuất bản Nụng nghiệp, Hà Nội, tr. 37 - 46.
11.Nguyễn Thị Kim Lan, Nguyễn Thị Lờ, Phạm Sỹ Lăng, Nguyễn Văn Quang (2008), Giỏo trỡnh ký sinh trựng học thỳ y, Nhà xuất bản Nụng nghiệp, Hà Nội, tr. 103 - 110.
12. Phan Địch Lõn (1985), “Những nghiờn cứu về sỏn lỏ gan và bệnh sỏn lỏ gan ở trõu bũ ở nước ta”, Khoa học kỹ thuật thỳ y, (6), tr. 29 – 32.
13. Phan Địch Lõn (1994, 2004), Bệnh ngó nước trõu bũ, Nhà xuất bản nụng nghiệp Hà Nội, tr. 5 - 55.
14. Đoàn Văn Phỳc, Nguyễn Thị Hiền Thảo, Vũ Thị Thận (1980), “Dựng Dertil cho uống tẩy sỏn lỏ gan trõu Việt Nam”, Kết quả nghiờn cứu khoa học và kỹ thuật thỳ y (1968 – 1978), Nhà xuất bản nụng nghiệp, Hà Nội.
15. Đoàn Văn Phỳc, Vương Đức Chất, Dương Thanh Hà (1995), “Kết quả điều tra nhiễm sỏn lỏ gan trõu, bũ khu vực Hà Nội và ứng dụng điều trị”, Cụng nghiệp và nụng nghiệp thực phẩm, Tạp chớ khoa học cụng nghệ và QLKT, Hà Nội.
16. Huỳnh Hồng Quang, Nguyễn Văn Khỏ (2008), “Bệnh SLGL trẻ em: đặc điểm lõm sàng, cận lõm sàng và hiệu quả phỏc đồ điều trị Triclabendazole tại khu vực miền Trung-Tõy Nguyờn, 2005-2007”, Tạp chớ y dược học quõn sự, 33(2), tr. 59 - 66.
17. Huỳnh Hồng Quang, Nguyễn Văn Văn (2011), “SLGL lạc chỗ ở người: Bỏo cỏo loạt ca bệnh và tổng hợp y văn thế giới và Việt Nam 2000-2011, Cụng trỡnh NCKH về bệnh truyền nhiễm và HIV/AIDS giai đoạn 2009 – 2011”, Tạp chớ Y học thực hành số 781-2011, ISSN 1859 - 1663, Bộ Y tế xuất bản, tr.118-123. 18.Phạm Văn Thõn, Huỳnh Hồng Quang (2007), “Đặc điểm sinh học và vài nột về
dịch tễ học bệnh SLGL (Fasciola hepatica và Fasciola gigantica)”, Tạp chớ y học thực hành thành phố Hồ Chớ Minh, (11), tr.2 - 6.
19. Đặng Tất Thế, Lờ Quang Hựng, Cao Văn Viờn (2003), “Định loại sỏn lỏ gan lớn (giống Fasciola) ở người và gia sỳc bằng chỉ thị DNA”, Tạp chớ Sinh học, 25(4), tr. 47 - 52.
20.Trịnh Văn Thịnh (1963), Ký sinh trựng thỳ y, Nhà xuất bản nụng thụn, Hà Nội, tr. 281 – 292.
21.Trịnh Văn Thịnh, Đỗ Dương Thỏi (1978), Cụng trỡnh nghiờn cứu ký sinh trựng thỳ y ở Việt Nam, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, (2).
22.Lương Thị Tố Thu, Bựi Khỏnh Linh (1996), “Tỡnh hỡnh nhiễm sỏn lỏ gan (Fasciola) và kết quả thử nghiệm Fasinex tẩy sỏn lỏ gan cho trõu bũ”, Tạp chớ khoa học kỹ thuật thỳ y, 3(1), tr. 74 – 81.
Tiếng Anh
23.Adlard RD, Barker SC, Blair D, Cribb TH, (1993), “Comparison of the second internal transcribed spacer (ribosomal DNA) from populations and species of Fasciolidae (Digenea)”, Int J Parasitol, 23, pp. 423-425.
24. Agatsuma T, Arakawa Y, Iwagami M, Honzako Y, Cahuaningsin U, Kang SY, Hong SJ(2000), “Molecular evidence of natural hybridization between”, Fasciola hepatica and F. Gigantica, Parasitol Int, 49, pp. 231-238.
25.Amer S, Dar Y, Ichikawa M, Fukuda Y, Tada C, Itagaki T, Nakai Y (2011), “Identification of Fasciola species isolated from Egypt based on sequence analysis of genomic (ITS1 and ITS2) and mitochondrial (NDI and COI) gene markers”, Parasitol Int, 60(1), pp. 5 - 12.
26.Amor N, Halajian A, Farjallah S, Merella P, Said K, Ben Slimane B (2011), “Molecular characterization of Fasciola spp. from the endemic area of northern Iran based on nuclear ribosomal DNA sequences”, Exp Parasitol,128(3), pp. 196-204.
27. Blair D, Agatsuma T, Watanobe T, Okamoto M and Ito A (1997), “Geographical genetic structure within the human lung fluke”, Paragonimus westermani, detected from DNA Sequences, Parasitology, 115, pp. 411-417.
28.Boore JL (1999), “Animal mitochondrial genomes”, Nucleic Acids Res, 27(8), pp. 1767-1178.
29.Dang TT, Nawa Y (2005), “Fasciola and Fascioliasis in Vietnam”, Asian Parasitol, 1, pp. 57 - 60.
30.Doanh PN, Guo Z, Nonaka N, Horii Y, Nawa Y (2013), “Natural hybridization between Paragonimus bangkokensis and Paragonimus harinasutai”, Parasitol Int,62(3), pp. 240-245.
31.Fritzscha G, Schjegel M, Stadler PF (2006), “Alignments of mitochondrial genome arrangements: applications to metazoan phylogeny”, J Theor Biol, 21, 240(4), pp. 511-520.
32.Guarro J, GenộJ, Stchigel AM (1999), “Review: Developments in fungal taxonomy”, Clin Microbiol Rev, 12(3), pp. 454-500.
33. Hashimoto KT, WatanobeC, Liu CX, Init I, Blair D, Ohnishi S, Agatsuma T (1997), “Mitochondrial DNA and nuclear DNA indicate that the Japanese Fasciola species is F. gigantica”, Parasitol Res, 83, pp. 220-225.
34.Hu M, Gasser RB (2006), “Mitochondrial genomes of parasitic nematodes- progress and perspectives”, Trends Parasitol, 22(2), pp. 78-84.
35.Huang YW, He B, Wang CR, Zhu XQ (2004), “Characterisation of Fasciola species from Mainland China by ITS-2 ribosomal DNA sequence”, Vet Parasitol, 120, pp. 75–83.