DNA tổng số của từng mẫu riờng biệt được tỏch chiết bằng QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN Inc. (Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. DNA tổng số được kiểm tra nồng độ bằng cỏch đo OD (Optical Density) trờn mỏy đo quang phổ kế Nanodrop 1000 spectrophotometer hoặc điện di trờn thạch agarose 1%.
Cỏch tiến hành:
Sử dụng bộ kit “Qiagen Genomic DNA Extraction Kit“ của hóng QIAGEN (Mỹ) để tỏch DNA tổng số:
Bước 1: Mẫu vật sau khi được xử lý rửa bằng nước nhiều lần để loại bỏ hết cồn trong quỏ trỡnh bảo quản mẫu, cắt 2 bờn rỡa của con sỏn (~25 mg); nghiền mẫu trong bộ cối chày nhựa thành dạng huyễn dịch đồng nhất.
Bước 2: Thờm 200àl dung dịch tissue lysis buffer (ATL). Bổ sung 20àl proteinase K (50mg/ml) + 4àl Rnase – A (100mg/ml), ủ trong bể điều nhiệt ở 550C trong 2 - 3 giờ, thỉnh thoảng vortex cho đến khi mụ được phõn hủy hoàn toàn.
Bước 3: Bổ sung 200 àl dung dịch binding buffer (AL), lắc mạnh rồi ủ ở 700C trụng 30 phỳt.
Bước 4: Thờm 200àl dung dịch izopropanol – 2 , vortex khoảng 15 giõy. Bước 5: chuyển toàn bộ hỗn dịch sang cột cú màng lọc, ly tõm 10.000 vũng/phỳt trong 1 phỳt, loại bỏ phần dung dịch phớa dưới cột lọc.
Bước 6: Thờm 500àl dung dịch washing buffer 1 (AW1) vào cột lọc để rửa DNA đó bỏm vào màng của cột lọc, ly tõm 13.000 vũng/phỳt trong 1 phỳt, bỏ dịch ly tõm bờn dưới cột.
Bước 7: Thờm 500àl dung dịch (Washinh buffer 2) AW2 vào cột lọc để rửa DNA, ly tõm 13.000 vũng/phỳt trong 1 phỳt, bỏ dịch ly tõm bờn dưới. Ly tõm lại 13.000 vũng/ phỳt trong 1 phỳt (để làm khụ màng).
Bước 8: Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1,5 ml mới, thờm 60 àl dung dịch elution buffer (EL), để ở nhiệt độ phũng trong 2 – 5 phỳt. Sau đú ly tõm 13000 vũng/phỳt trong 2 phỳt. Bỏ cột, giữ lại dịch bờn dưới.
Ghi ký hiệu mẫu DNA tổng số và bảo quản ở - 200C cho đến khi sử dụng.