Mẫu sỏn lỏ gan lớn FspCB-VN (Cao Bằng) và FspNB-VN (Ninh Bỡnh) được tỏch DNA tổng số làm khuụn cho phản ứng PCR. Cỏc chuỗi gen ITS-2 được nhõn lờn bằng phản ứng PCR với cỏc cặp mồi 3SF – BD2R. Vựng giao gen ITS- 2 cú độ dài khoảng 550 bp (gồm cả phần 5,8S và 28S của mồi bỏm vào). Kết quả PCR được trỡnh bày ở hỡnh 3.2.
Hỡnh 3.2. Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR của vựng gen ITS-2.
1. Sản phẩm PCR của mẫu FspNB cú kớch thước ~ 0,5 kb;
2. Sản phẩm PCR của mẫu FspCB cú kớch thước ~ 0,5 kb; M: Chỉ thị phõn tử Lamda cắt bằng enzyme HindIII
Hỡnh ảnh ở hỡnh 3.2 cho thấy, sản phẩm PCR cú độ dài đỳng với dự kiến (~ 0,5 kb) là một băng DNA sỏng rừ, đơn băng chứng tỏ cặp mồi bỏm đặc hiệu và chu trỡnh nhiệt phự hợp. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit AccuPrep™ Gel Purification Kit (Bioneer, Hàn Quốc).
Sử dụng chuỗi nucleotide của FspNB-VN và FspCB-VN để blast vào Ngõn hàng gen thu nhận cỏc chuỗi tương ứng. So sỏnh và đối chiếu trỡnh tự gen ITS-2 của 16 chuỗi, trong đú gồm: 2 chuỗi trong nghiờn cứu và 14 chuỗi nucleotide gen ITS-2 đó đăng ký trong Ngõn hàng gen được sắp xếp và trỡnh bày ở hỡnh 3.3.
M 1 2 0,5 kb 564 bp 2 kb 23,1 kb A
Hỡnh 3.3. So sỏnh trỡnh tự chuỗi nucleotide ITS-2của 16 mẫu Fasciola sp. Dấu (.) biểu thị sự giống nhau. Sự sai khỏc được thể hiện bằng cỏc chữ cỏi (7 vị trớ). Vị trớ 327 được đúng khung đó được xỏc định đõy là vị trớ phõn biệt nhận biết
giữa Fassciola gigantiaca thuần (pure) và Fasciola hepatica với loài lai. Hai mẫu FspNB-VN và FspCB-VN được so sỏnh và sắp xếp ở hàng trờn cựng. * 20 * 40 * 60 * FspNB-VN-3 : ATAAACTATCACGACGCCCAAAAAGTCGTGGCTTGGGTTTTGCCAGCTGGCGTGATCTCCTCTATGAGTAATCAT : 75 FspCB-VN-3 : ... : 75 Fsp(Hel)CN : ... : 75 FspSaita-J : ... : 75 Fg-GX-CN-A : ... : 75 Fg-TL-AB20 : ... : 75 FspBDB-VN- : ... : 75 Fg(IndoT)- : ... : 75 Fh-UR-AB01 : ... : 75 FspHokai-J : ... : 75 Fh-IR-AB20 : ... : 75 Fh(Ca)SP-A : ... : 75 Fh-FR-AJ55 : ... : 75 Fsp-GHL-20 : ... : 75 Fsp(hu)-TL : ... : 75 FspCB-Khan : ... : 75 80 * 100 * 120 * 140 * FspNB-VN-3 : GTGAGGTGCCAGATCTATGGCGTTTCCCTAATGTATCCGGATGCACCCTTGTCTTGGCAGAAAGCCGTGGTGAGG : 150 FspCB-VN-3 : ... : 150 Fsp(Hel)CN : ... : 150 FspSaita-J : ... : 150 Fg-GX-CN-A : ... : 150 Fg-TL-AB20 : ... : 150 FspBDB-VN- : ... : 150 Fg(IndoT)- : ... : 150 Fh-UR-AB01 : ... : 150 FspHokai-J : ... : 150 Fh-IR-AB20 : ... : 150 Fh(Ca)SP-A : ... : 150 Fh-FR-AJ55 : ... : 150 Fsp-GHL-20 : ... : 150 Fsp(hu)-TL : ... : 150 FspCB-Khan : ... : 150 160 * 180 * 200 * 220 FspNB-VN-3 : TGCAGTGGCGGAATCGTGGTTTAATAATCGGGTTGGTACTCAGTTGTCAGTGTGTTCGGCGATCCCCTAGTCGGC : 225 FspCB-VN-3 : ...T... : 225 Fsp(Hel)CN : ...T... : 225 FspSaita-J : ...C... : 225 Fg-GX-CN-A : ... : 225 Fg-TL-AB20 : ... : 225 FspBDB-VN- : ... : 225 Fg(IndoT)- : ... : 225 Fh-UR-AB01 : ...T... : 225 FspHokai-J : ...T... : 225 Fh-IR-AB20 : ...T... : 225 Fh(Ca)SP-A : ...T... : 225 Fh-FR-AJ55 : ...T... : 225 Fsp-GHL-20 : ...T... : 225 Fsp(hu)-TL : ...T... : 225 FspCB-Khan : ...T... : 225 * 240 * 260 * 280 * 300 FspNB-VN-3 : ACACTCATGATTTCTGGGATAATTCCATACCAGGCACGTTCCGTTACTGTTACTTTGTCATTGGTTTGATGCTGA : 300 FspCB-VN-3 : ...T...C...C... : 300 Fsp(Hel)CN : ...T...C...C... : 300 FspSaita-J : ... : 300 Fg-GX-CN-A : ... : 300 Fg-TL-AB20 : ... : 300 FspBDB-VN- : ... : 300 Fg(IndoT)- : ... : 300 Fh-UR-AB01 : ...T...C...C...T... : 300 FspHokai-J : ...T...C...C... : 300 Fh-IR-AB20 : ...T...C...C... : 300 Fh(Ca)SP-A : ...T...C...C... : 300 Fh-FR-AJ55 : ...T...C...C... : 300 Fsp-GHL-20 : ...T...C...C... : 300 Fsp(hu)-TL : ...T...C...C... : 300 FspCB-Khan : ...T...C...C... : 300 * 320 * 340 * 360 FspNB-VN-3 : ACTTGGTCATGTGTCTGATGCTATTT-CATATAACGACGGCACCCTTCGTGGTCTGTCTTCC : 361 FspCB-VN-3 : ...T...G...T... : 362 Fsp(Hel)CN : ...T...G...AT... : 362 FspSaita-J : ...-...T... : 361 Fg-GX-CN-A : ...-...AT... : 361 Fg-TL-AB20 : ...-...T... : 361 FspBDB-VN- : ...-...T... : 361 Fg(IndoT)- : ...-...T... : 361 Fh-UR-AB01 : ...T...G...T... : 362 FspHokai-J : ...T...G...T... : 362 Fh-IR-AB20 : ...T...G...T... : 362 Fh(Ca)SP-A : ...T...G...T... : 362 Fh-FR-AJ55 : ...T...G...AT... : 362 Fsp-GHL-20 : ...T...G...T... : 362 Fsp(hu)-TL : ...T...G...T... : 362 FspCB-Khan : ...T...G...T... : 362
Kết quả ở hỡnh 3.3 cho thấy, chuỗi ITS-2 ở Việt Nam và thế giới được chia làm hai loại: loại cú độ dài 361 nucleotide và loại cú độ dài 362 nucleotide, cú sự sai khỏc ở 7 vị trớ chớnh giữa F.gigantia và F.hepaticavà cỏc loại trung gian: 207 (C/T), 231 (C/T), 270 (T/C), 276 (T/C), 327 (-/T), 334 (A/G), 341(T/A). Vị trớ 327 cú thờm nucleotide là Thymine (T) trong ITS-2 của F.hepatica, đõy là chỉ thị cú tớnh quyết định phõn biệt giữa F.gigantica (361 nucleotide) và F.hepatica (362 nucleotide). Như vậy, 16 chuỗi ITS-2 so sỏnh được chia làm hai nhúm đại diện
F.gigantica và F.hepatica tạo nờn cỏc dũng thuần và dũng lai trong quần thể
Fasciola sp.
Bảy vị trớ biến đổi của nucleotide đó được xỏc định trờn trỡnh tự của gen ITS-2 (danh sỏch được liệt kờ ở bảng 3.1), trong đú tại vị trớ 327 thỡ mẫu FspCB- VN cú Thymine, cũn mẫu FspNB-VN khụng cú nucleotide tại vị trớ 327. Vựng giao gen ITS-2 của cỏc mẫu sỏn lỏ gan lớn của 16 chuỗi so sỏnh đối chiếu cú độ dài khỏc nhau: 361 bp hoặc 362 bp, chờnh lệch nhau bởi một nucleotide(T) ở vị trớ 327 (Hỡnh 3.3).
Trỡnh tự nucleotide gen ITS-2 của 2 mẫu sỏn lỏ gan lớn FspCB-VN và FspNB-VN được so sỏnh với ITS-2 của mẫu FgIN của Indonesia (đặc trưng cho
F. gigantica thuần) và mẫu Fasciola Fh-FR của Phỏp (đặc trưng cho loài F. hepatica thuần) với một số mẫu thu ở cỏc vật chủ khỏc nhau. Mẫu Fsp-GHL- 2014-CN của Trung Quốc là mẫu tham chiếu cho loài lai.
Trong quỏ trỡnh phõn tớch và nghiờn cứu, chỳng tụi đó chỳ trọng vấn đề thu thập cỏc mẫu tương ứng từ cỏc mẫu cú nguồn gốc ở cỏc nước đại diện chõu lục (chõu Âu, chõu Á, chõu Mỹ) và trờn cỏc đối tượng vật chủ khỏc nhau (trõu, bũ, dờ, cừu, người...) cú trong ngõn hàng gen hoặc từ tài liệu tham khảo để so sỏnh đối chiếu (Bảng 3.1), trong đú gồm cỏc mẫu nguồn gốc Việt Nam, Thỏi Lan, Trung Quốc, Nhật Bản, Phỏp, Tõy Ban Nha, Ireland, Indonesia và Uruguay.
Gen ITS-2 đó được sử dụng nhiều trong việc định loài và đặc biệt đối với loài sỏn lỏ gan lớn [24], [39], [47]. Sự khỏc nhau giữa số lượng của cỏc cặp nucleotide của gen ITS-2 là một đặc điểm để phõn biệt giữa hai loàiF. gigantica và
F. hepatica: Sự thiếu hụt 1 cặp nucleotide ở vị trớ số 327 của ITS-2 làm cho tổng số cặp nucleotide cũn 361, cho phộp xỏc định gen ITS-2 đú sẽ thuộc về nhúm F. gigantica và số cặp nucleotide là 362 thỡ gen ITS-2 thuộc nhúm F. hepatica.
của cỏc mẫu sỏn lỏ gan lớn ở cỏc vựng địa lý và vật chủ khỏc nhau
Số TT
Ký hiệu Nguồn gốc Vật chủ Vị trớ biến đổi trong gen ITS-2 Cơ sở
dữ liệu
Đỏnh giỏ phõn loại
207 231 270 276 327 334 341
1
FspNB-VN Việt Nam Trõu C C T T - A T NC này F. giantica
-like*
2
FspCB-VN Việt Nam Bũ T T T T T A T NC này
F. hepatica- like* 3 Fsp(He1)- CN Trung
Quốc Cừu C C T T T A A AJ557570
F. hepatica- like*
4
FspSaita-JP Nhật Bản Bũ C C T T - A T AB207151 F. giantica -
like*
5
Fg(GX)-CN Trung
Quốc Trõu C C T T - A A AJ557569 F. giantica 6 Fg-TL Thỏi Lan Cattle
C C T T - A T AB207149 F. giantica
7
FspBDB-VN Việt Nam Bũ C C T T - A T EU260057 F. giantica
8
Fg(IndoT) Indonesia Cattle C C T T - A T AB010977 F. giantica
9
Fh-UR Uruguay Cattle T T C C T G T AB010974 F. hepatica
10
FspHokai-JP Nhật Bản Bũ T T C C T G T AB207150 F. hepatica
11
Fh-IR Ireland Cattle T T C C T G T AB207148 F. hepatica
12
Fh(Ca)SP Tõy Ban
Nha N/A T T C C T G T AJ272053 F. hepatica 1 13
Fh-FR Phỏp Bũ sữa T T C C T G A AB557567 F. hepatica
14 Fsp-GHL- 2014-CN Trung Quốc Bũ sữa T T T T T G T KF543341 F. hepatica- like* 15 Fsp(hu)-
2015-TL Thai lan Người T C C T G T KF687908 F. hepatica-
like*
16 Fsp-
Khanhct11.2- VN
Việt Nam Cattle T T C C T G T AB536918 F. hepatica-
like
Ghi chỳ: F. giantica -like*:dạng trung gian giống F. gigantica; F. hepatica - like*: dạng trung gian giống F. hepatica.
Mẫu sốTT (8) Fg(IndoT) tham chiếu cho F.gigantica dạng thuần; (11) Fh-FR tham chiếu cho F. hepatica; (14):Fsp-GHL-2014-CN tham chiếu cho dạng lai (hybrid form).
Kết quả nghiờn cứu này của chỳng tụi cũng phự hợp với kết quả khi giỏm định gen của cỏc mẫu sỏn ở vựng Đụng và Đụng Nam Á: Trung Quốc [35], Hàn Quốc [24], Việt Nam [39], [47], [55], đú cũng là những bằng chứng để khẳng định khả năng hỡnh thành một số dạng di truyền (genotype) mới trong quần thể sỏn lỏ gan lớn tại Việt Nam và thế giới [2], [46].