b) Phân lập tế bào Lymph oT từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi
3.6. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của tế bào tua và Exsome lên sự sinh trƣởng của tế
cao với tỷ lệ CD3 chiếm 98,7 ± 0,5%.
Hình 3.7 Phân tích quần thể tế bào lympho T bằng phƣơng pháp tế bào theo dịng chảy
Phân tích tế bào đơn dựa trên hai chỉ số FSA và FSH. Tỷ lệ tế bào sống sau đĩ được xác đ nh là các tế bào dương tính với 7-AAD trong quần thể tế bào Lympho. Các tế bào T CD4+ và CD8+ được phân biệt với nhau trong quần thể tế bào T CD3+. Các số hiển th trên hình ảnh là tỷ lệ phần trăm của quần thể tế bào.
3.6. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của tế bào tua và Exsome lên sự sinh trƣởng của tế bào lympho T tế bào lympho T
- Để xác đ nh khả năng kích thích tăng sinh tế bào lympho T của các Exosome phân lập từ mơi trường nuơi cấy DC và DCno, các tế bào lympho T máu ngoại vi người khỏe mạnh được nhuộm với thuốc nhuộm Carboxyfluorescein succinimidyl ester CFSE sau đĩ đồng nuơi cấy với các Exosome phân lập từ mơi trường nuơi cấy DC,
DCno máu cuống rốn trữ đơng. CFSE là thuốc nhuộm cĩ tính xuyên màng, khơng màu và khơng phát huỳnh quang khi nhĩm acetate được loại bỏ bởi các esterases nội bào trong các tế bào sống. Khi b phân cắt, CFSE liên kết cộng hĩa tr với nhĩm amin cĩ trong tế bào thơng qua nhĩm succinimidyl ester và phát tín hiệu huỳnh quang tại bước sĩng kích thích 490nm. CFSE tồn tại ở trong các tế bào sống và giảm một nửa tín hiệu huỳnh quang tại các thể hệ phân bào tiếp theo.
Hình 3.8: Sự tăng sinh tế bào lympho T CD3+ khi nhuộm CSFE.
Tế bào Lympho T được phân chia hai lần trong thời gian đồng nuơi cấy 7 ngày với DC đã được cảm ứng kháng nguyên A549 và phân chia một lần với DC khơng được cảm ứng với kháng nguyên (DCno) hoặc Exosome phân lập từ DC (Exo). Các tế bào Lympho T khơng được đồng nuơi cấy với DC/Exosome hoặc các tế bào Lympho T được ủ với các Exosome được phân lập từ mơi trường nuơi cấy DC khơng cảm ứng với kháng nguyên A549 (Exono) khơng phân chia. (T cell_DC: tế bào Lympho T đồng nuơi cấy với DC, T cell_DCno: tế bào Lympho T đồng nuơi cấy với DCno, T cell_Exo: tế bào Lympho T đồng nuơi cấy với Exo, T cell_Exono: tế bào Lympho T đồng nuơi cấy với Exono. T cell: tế bào Lympho T được nuơi cấy độc lập)
- Các phản ứng tăng sinh của các tế bào lympho T được xác đ nh bằng cách đo mật độ tín hiệu huỳnh quang (Fluorescence intensity FI) CFSE. Kết quả nghiên cứu cho thấy (Hình 3.8) các tế bào lympho T khi đồng nuơi cấy với DC cảm ứng với protein A549 (T cell_DC) cĩ tỷ lệ tăng sinh cao nhất, với sự phân chia lớn gấp hai lần trong 7 ngày nuơi cấy khi so sánh với các tế bào lympho T được ủ với DC khơng cảm ứng với protein A549 (Tcell_DCno). Các tế bào lympho T đồng nuơi cấy với Exosome phân lập từ DC (Tcell_Exo) cũng cĩ số lượng tế bào tăng sinh gấp 2 lần.
Tuy nhiên, khơng ghi nhận thấy sự phân chia khi quan sát các tế bào Lympho T nuơi cấy độc lập (Tcell), là các tế bào Lympho T khơng cĩ khả năng tăng sinh in vitro khi khơng cĩ sự kích thích.
- Kết quả sự tăng sinh tế bào lympho T đồng lồi trong cả hai trường hợp đồng nuơi cấy tế bào Lympho T với DC và DCno tương tự như báo cáo trước đây [25]. Qing Ge và cộng sự đã chứng minh rằng tế bào lympho T tăng sinh mạnh khi tỷ lệ đồng nuơi cấy với DC là 2,5: 1 hoặc 5:1. Hơn nữa Nowruz el đã chứng minh rằng DC cĩ thể kích thích các tế bào Lympho T đồng lồi bằng khả năng trình diện kháng nguyên của chúng, phù hợp với các đặc tính của DC như quá trình tiết ra các cytokine đáp ứng miễn d ch [9]. Sự tăng sinh gấp 2 lần ở nhĩm tế bào Lympho T đồng nuơi cấy với DC được kích thích kháng nguyên A549 (Tcell_DC) so với nhĩm lympho T đồng nuơi cấy với DC khơng được cảm ứng với kháng nguyên A549 (Tcell_DCno) đã chỉ ra rằng khả năng trình diện kháng nguyên của DC tốt hơn khi được cảm ứng với tác nhân lạ. Kết quả cũng tương tự như trong nghiên cứu cứu của Miwa và đồng nghiệp [67].
- Từ kết quả tăng sinh gần 2 lần tế bào lympho T khi đồng nuơi cấy với Exo tiết từ tế bào DC cĩ cảm ứng kháng nguyên (Tcell_Exo) so với tế bào lympho T khi đồng nuơi cấy với Exo tiết từ tế bào DC khơng cảm ứng kháng nguyên và tế bào Lympho T nuơi cấy độc lập, cĩ khả năng Exosome biểu hiện các kháng nguyên A549 lên bề mặt và kích thích sự tăng sinh tế bào lympho T khi trình diện các kháng nguyên đĩ, bao gồm cả tế bào tế bào lympho T CD4+ và CD8+. Kết cuả đồng quan điểm với Charlotte Admyre và cộng sự khi chứng minh sự tăng sinh của tế bào CD8+ khi được kích thích với Exosom tiết từ DC cĩ nguồn gốc từ tế bào mono cũng như kích thích tế bào CD4+ tốt hơn giữa Exosome tiết từ tế bào DC trưởng thành và DC chưa trưởng thành [1].
- Trong nghiên cứu này, DC và Exosome tiết từ DC cho thấy khả năng kích thích tăng sinh tế bào Lympho T, tuy nhiên số lượng Exosome thu được đến từ nhiều loại tế bào khác nhau tồn tại trong d ch nuơi cấy tế bào. Vì vậy, cần xác đ nh rõ tỷ lệ
Exosome cĩ khả năng trình diện kháng nguyên trong hỗn hợp thu được để xác đ nh cơng suất, tính hiệu kích thích tăng sinh tế bào Lympho T so với DC.
3.7. Kết quả đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thƣ biểu mơ phế nang phổi A549 của tế bào lympho T đã cảm ứng
- Khả năng gây độc tế bào của tế bào Lympho T được đánh giá dựa trên sự kháng lại các tế bào A549 được nhuộm với thuốc nhuộm Calcein - acetoxymethyl ester (Calcein-AM). Khi đi qua màng tế bào, nhĩm acetoxymethyl ester của thuốc nhuộm b thủy phân bởi các esterases nội bào, kích thích thuốc nhuộm phát hình quang. Mật độ huỳnh quang FI của Calcein tỷ lệ thuận với tỷ lệ tế bào sống.
- Kết quả trong nghiên cứu chỉ ra rằng cĩ sự giảm mức độ tín hiệu huỳnh quang đáng kể sau khi dịng tế bào A549 phản ứng với tế bào Lympho T đã được cảm ứng sau thời gian ủ trong 2 giờ (Hình 3.9). Trong nghiên cứu này, tế bào A549 được đồng nuơi cấy với tế bào lympho T tại các nồng độ khác nhau lần lượt là 1/12,5; 1/25; 1/50. Tỷ lệ gây độc tế bào của Lympho T đối với tế bào A549 được quy đổi thành biểu đồ tuyến tính từ mức độ tín hiệu huỳnh quang (Hình 3.10). Tại các tỷ lệ tế bào Lympho T so với tế bào ung thư A549 (E/T) càng cao thì tín hiệu giảm càng mạnh, chứng tỏ vài trị tiêu diệt tế bào A549 của tế bào T gây độc CD8+ tỷ lệ thuận với mật độ tế bào. Lympho T đồng nuơi cấy với DC cĩ cảm ứng kháng nguyên cho thấy khả năng gây độc tế bào tế bào A459 cao nhất. Trong khi đĩ gần như khơng cĩ sự khác biệt FI giữa tế bào Lympho T đồng nuơi cấy với Exosome từ mơi trường DC cảm ứng kháng nguyên (Exo) và DC khơng cảm ứng kháng nguyên (DCno) ở các tỷ lệ E/T thấp, ngoại trừ tỷ lệ E/T=50/1 cho thấy Lympho T đồng nuơi cấy với Exosome từ mơi trường DC cảm ứng kháng nguyên (Exo) cĩ khả năng tiêu diệt tế bào cao hơn DC khơng cảm ứng kháng nguyên (DCno). Cụ thể độc tính của tế bào lympho T đồng lồi được cảm ứng với DCno và Exo lần lượt là 37% và 50% khi tỷ lệ E/T=50/1, 31% và 26% khi E/T=25/1 và 26% và 13% khi E/T=12,5/1. Trong khi đĩ độc tính tế bào lympho T cảm ứng Exono cho
tỷ lệ thấp nhất với giá tr lần lượt là 21%, 11%, 9% khi tỷ lệ E/T lần lượt là 50/1, 25/1 và 12,5/1.
Hình 3.9: Hoạt tính gây độc lên tế bào A54 của tế bào Lympho T.
Tín hiệu huỳnh quang FI của tế bào A549 sau khi đồng nuơi cấy trong 2 giờ với các tế bào lympho T cảm ứng với các điều kiện khác nhau. (T cell_DC: tế bào Lympho T đồng nuơi cấy với
DC, T cell_DCno: tế bào Lympho T đồng nuơi cấy với DCno, T cell_Exo: tế bào Lympho T đồng nuơi cấy với Exo, T cell_Exono: tế bào Lympho T đồng nuơi cấy với Exono, T cell: tế bào
Lympho T được nuơi cấy độc lập)
- Kết quả từ Casper J. E. Wahlund (2017) đã chứng mình khả năng kích thích tăng sinh tế bào T CD8+ đặc hiệu kháng nguyên của Exosome tiết từ tế bào tua cảm ứng
với Ovalbumin. Trong cùng nghiên cứu, exosome thúc đẩy tế bào lách chuột tiết
Interferon γ đáp ứng miễn d ch ex vivo [71]. Các Exosome thu được từ DC cĩ thể kích thích tăng sinh tế bào T CD8+ in vitro và in vivo mạnh hơn các exosome tiết từ DC chưa trưởng thành, và kích thích tế bào CTLs đặc hiệu khối u tăng sinh tăng khả năng miễn d ch kháng khối u [27, 66]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, Exosome tiết từ DC cĩ cảm ứng và khơng cảm ứng kháng nguyên chưa thể hiện rõ mức độ kích thích tế bào Lympho T tiêu diệt tế bào ung thư A549 và kém hơn hiệu quả tiêu diệt của DC, khơng loại trừ trường hợp liều lượng Exosome thu được cịn thấp chưa đủ để kích thích tăng sinh mạnh cũng như khả năng gây độc của tế bào Lympho T.
Hình 3.10: Tỷ lệ hoạt tính gây độc tế bào (mẫu 1)
- Gần đây Gruijl và cộng sự đã trình bày kết quả của thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I liên quan đến việc cấy ghép DC đồng lồi để điều tr bệnh bạch cầu tủy cấp tính [19]. Kết luận chỉ ra rằng việc điều tr là an tồn, khả thi và cĩ thể kich thích các mức độ đáp ứng miễn d ch khác nhau, ngay cả khi khơng cĩ kết hợp hệ thống kháng nguyên bạch cầu người (human leucocyte antigen-HLA) [68]. Tương tự trong nghiên cứu này, chúng tơi khơng thực hiện kiểm tra mức độ HLA tại bốn mẫu máu cuống rốn trữ đơng đối với các tế bào Lympho T từ máu ngoại vi người khỏe mạnh. Tuy nhiên, kết quả cho thấy DC đồng lồi và Exosome được tiết ra của chúng cĩ thể đáp ứng miễn d ch kháng ung thư biểu mơ phế nang phổi A549 in
vitro và tế bào tua được cảm ứng với kháng nguyên cĩ khả năng trình diện kháng
nguyên tốt hơn so với tế bào tua khơng được cảm ứng kháng nguyên trong kích thích tắng sinh tế bào Lympho T. Với tiềm năng đã được nghiên cứu từ DC, Dex trong liệu pháp miễn d ch, máu cuống rỗn trữ đơng cĩ thể là nguồn cung cấp một lưộng lớn DC, Dex cho liệu pháp miễn d ch và đĩng vai trị là nguồn dự trữ sẵn sàng để sản xuất vắc xin. 43 75 80 26 31 37 13 26 50 9 11 21 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 12.5 25 50 T ỷ lệ % ho ạt tín h gây đ ộc tế bào Tỷ lệ E/T
Khả năng tiêu diệt tế bào A549
Chƣơng 4 - KẾT LUẬN
Từ những những kết quả thu được trong các thí nghiệm trên, rút ra những kết luận sau:
- Phân lập được tế bào mono từ máu cuống rốn trữ đơng với hiệu suất xấp xỉ 40% - Biệt hĩa và trưởng thành thành cơng DC từ tế bào đơn nhân máu cuống rốn trữ
đơng trong mơi trường KBM 551 cĩ chứa các cytokine GM-CFS, IL-4, và TNF-α: kích thước lớn, xuất hiện tua dài và sự biểu hiện cao các dấu ấn bề mặt điển hình ở DC, gồm: HLA-DR (41.0 ± 28.4 %), CD11c (40.9 ± 29.6), CD80 (80.4 ± 29.1 %), CD40 (41.9 ± 8.9 %), CD86 (80.6 ± 16.8 %)
- Phân lập tế bào Lympho T từ máu ngoại vi cĩ độ tinh sạch cao (CD3+: 98.7±0.5%) - Thu nhận được dung d ch cĩ khả năng cao chứa Exosome tiết từ tế bào tua.
- DC cảm ứng với kháng nguyên A549, và Exosome tiết từ mơi trường nuơi cấy DC cảm ứng kháng nguyên A549 cĩ khả năng kích thích tăng sinh tế bào lympho T thơng qua việc phân chia tế bào (từ 1-2 thế hệ), và cĩ khả năng tiêu diệt tế bào ung thư A549 mạnh hơn so với các tế bào khơng được cảm ứng.
Chƣơng 5 - KIẾN NGHỊ
- Theo nghiên cứu của Phạm Văn Phúc và cộng sự sử dụng MNC từ máu cuống rốn để biệt hĩa thành DC cho tỷ lệ sống tế bào cao >90% [69]. Thay vì sử dụng nguồn máu cuống rốn trữ đơng thu MNC tế bào MNC nên được phân lập khi thu thập máu cuống rốn trước khi trữ đơng.
- Kiểm tra chất lượng Exosome thu được từ quá trình siêu ly tâm, kiểm tra nồng độ cytokine tiết ra từ quá trình đồng nuơi cấy tế bào Lympho T với Exosome, tế bào tua để đánh giá hiệu quả kích thích miễn d ch kháng ung thư
- Tiến hành thí nghiệm đối chứng với DC được biệt hĩa từ tế bào đơn nhân máu cuống rốn tươi và DC đồng nuơi cấy với tế bào Lympho T tự thân để so sánh sự khác biệt trong khả năng kích thích kháng ung thư
- Tiến hành thí nghiệm đối chứng Exosome thu được từ mơi trường nuơi cấy DC từ máu cuống rốn tươi và Exosome thu được từ mơi trường nuơi cấy DC với tế bào Lympho T tự thân để so sánh sự khác biệt trong khả năng kích thích kháng ung thư
Chƣơng 6 – TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Admyre C. S.M. Johansson S. Paulie and S. Gabrielsson (2006) ―Direct exosome stimulation of peripheral humanT cells detected by ELISPOT‖ European journal of
immunology, 36 (7), pp. 1772-1781.
2. Aldahlawi A.M. and Ultrastructure (2016) ―Modulation of dendritic cell immune functions by plant components‖ Journal of microscopy, 4 (2), pp. 55-62.
3. Allan R.S., J. Waithman, S. Bedoui, C.M. Jones, J.A. Villadangos, Y. Zhan, A.M. Lew, K. Shortman W.R. Heath and F.R. Carbone (2006) ―Migratory dendritic cells transfer antigen to a lymph node-resident dendritic cell population for efficient CTL priming‖
Immunity, 25 (1), pp. 153-162.
4. André F., N. Chaput, N.E. Schartz, C. Flament, N. Aubert, J. Bernard, F. Lemonnier, G. Raposo, B. Escudier, and D.-H. Hsu (2004) ―Exosomes as potent cell-free peptide-based vaccine. I. Dendritic cell-derived exosomes transfer functional MHC class I/peptide complexes to dendritic cells‖ The Journal of Immunology, 172 (4), pp. 2126-2136.
5. Andre F., B. Escudier, E. Angevin, T. Tursz and L. Zitvogel (2004) ―Exosomes for cancer immunotherapy‖ Ann Oncol, 15 (Suppl 4), pp. iv141-144.
6. Antoniewicz‐Papis J. E. Lachert J. Woźniak K. Janik and M. Łętowska (2014)
―Methods of freezing cord blood hematopoietic stem cells‖ Transfusion, 54 (1), pp. 194- 202.
7. Ballen K. F. Verter and J. Kurtzberg (2015) ―Umbilical cord blood donation: public or private?‖ Bone marrow transplantation, 50 (10), pp. 1271.
8. Ballen K.K. E. Gluckman and H.E. Broxmeyer (2013) ―Umbilical cord blood
transplantation: the first 25 years and beyond‖ Blood, The Journal of the American Society
of Hematology, 122 (4), pp. 491-498.
9. Banchereau J. and R.M. Steinman (1998) ―Dendritic cells and the control of immunity‖
Nature, 392 (6673), pp. 245.
10. Beauvillain C., S. Ruiz, R. Guiton, D. Bout, I. Dimier-Poisson and Infection (2007) ―A vaccine based on exosomes secreted by a dendritic cell line confers protection against T. gondii infection in syngeneic and allogeneic mice‖ Microbes, 9 (14-15), pp. 1614-1622. 11. Besse B., M. Charrier, V. Lapierre, E. Dansin, O. Lantz, D. Planchard, T. Le Chevalier, A.
Livartoski F. Barlesi and A. Laplanche (2016) ―Dendritic cell-derived exosomes as maintenance immunotherapy after first line chemotherapy in NSCLC‖ Oncoimmunology, 5 (4), pp. e1071008.
12. Brode S. and P.A. Macary (2004) ―Cross‐presentation: dendritic cells and macrophages bite off more than they can chew!‖ Immunology, 112 (3), pp. 345-351.
13. Buschow S.I., E.N. Nolte‐‗T Hoen G. Van Niel M.S. Pols, T. Ten Broeke, M. Lauwen, F. Ossendorp C.J. Melief G. Raposo and R. Wubbolts (2009) ―MHC II in dendritic cells is targeted to lysosomes or T cell‐induced exosomes via distinct multivesicular body
pathways‖ Traffic, 10 (10), pp. 1528-1542.
14. Carbone D.P., D.R. Gandara, S.J. Antonia, C. Zielinski, and L. Paz-Ares (2015) ―Non– small-cell lung cancer: role of the immune system and potential for immunotherapy‖
Journal of Thoracic Oncology, 10 (7), pp. 974-984.
15. Castell-Rodríguez A., G. Piđĩn-Zárate, M. Herrera-Enríquez, K. Jarquín-Yáđez, and I.