- Chai nuơi cấy tế bào DC sau khi hút mơi trường nuơi cấy ra được rửa bằng PBS 2 lần để loại bỏ hồn tồn mơi trường
- Bổ sung trypsin, phủ tồn bộ bề mặt chai nuơi cấy (3ml trypsin với chai T75)
- Ủ ấm chai nuơi cấy tại 37oC, 5% CO2 trong 3 phút, kiểm tra cho đến khi thấy tế bào bắt đầu bong ra khỏi bề mặt chai nuơi cấy, bổ sung 3ml mơi trường RPMI 1640 để bất hoạt trypsin
- Thu tồn bộ tế bào ra các ống mới, ly tâm tại 270×g trong 8 phút để loại d ch nổi, thu tế bào.
- Đếm tế bào: Nhuộm tế bào với thuốc nhuộm trypan blue theo tỉ lệ 1:1 về thể tích và đếm trên buồng đếm tế bào. Số lượng tế bào được tính như sau:
Số lượng tế bào DC = 2 Thể tích (ml)
- Tế bào thu được gồm tế bào tua cĩ cảm ứng với kháng nguyên DC và tế bào tua khơng cảm ứng kháng nguyên DCno
2.3.7. Thu nhận Exosome từ mơi trƣờng nuơi cấy tế bào tua máu cuống rốn trữ đơng
- Phân lập Exosome: Mơi trường nuơi cấy DC/DCno được thu vào các ống ly tâm (khoảng 45ml), sử dụng phương pháp siêu ly tâm để phân lập Exosome.
- Ly tâm mơi trường thu được tại 270×g trong 8 phút tại 20oC để loại bỏ cặn là xác tế bào và các mảnh vỡ tế bào, thu phần d ch nổi.
- D ch nổi được ly tâm tiếp tại 2.500×g trong 20 phút tại 4oC để loại cặn tế bào là các thể Apototic, thu phần d ch nổi vào các ống siêu ly tâm, cân chính xác (sai số ±0,001g)
- Ly tâm siêu tốc phần d ch nổi tại 16.500×g trong 30 phút tại 4oC loại cặn là các bĩng bào kích thước micro (Microvesicle), thu d ch vào các ống siêu ly tâm mới, cân chính xác (sai số ±0,001g)
- Ly tâm siêu tốc phần d ch nổi trên tại 100.000×g trong 90 phút tại 4oC, loại bỏ phần d ch nổi. Dùng pipet hút từ từ, nhẹ nhàng để lại phần d ch 200 µl, thu cặn là Exsosome vào ống siêu ly tâm mới
- Bổ sung 2ml mơi trường KBM 551 vào ống siêu ly tâm mix đều, ly tâm siêu tốc 100.000×g trong 90 phút tại 4oC để rửa, loại bỏ các protein cĩ trong ống
- Sau ly tâm, dùng pipet hút nhẹ nhàng để loại bỏ d ch nổi để lại phần d ch 200µl, mix, hút chuyển sang ống 1,5ml để sử dụng cho bước tiếp theo hoặc lưu trữ và bảo quản tại -20oC hoặc -80oC
- Exosome thu được gồm hai loại: Exosome từ mơi trường nuơi cấy DC là Exo và Exosome từ mơi trường nuơi cấy DCno là Exono.
2.3.8. Phân lập tế bào lympho T từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi a) Phân lập tế bào đơn nhân máu ngoại vi a) Phân lập tế bào đơn nhân máu ngoại vi
- 15ml máu ngoại vi người khỏe mạnh sau khi được pha lỗng với PBS, ly tâm cùng với Ficoll theo tỷ lệ 2:1 về thể tích tại 840×g trong 20 phút, gia tốc chậm, khơng phanh.
- Sau ly tâm, dung d ch chia làm 4 phần như hình 2.5: Lớp trên cùng màu vàng nhạt: hỗn hợp dung d ch plasma và PBS. Lớp thứ hai là Buffy coat chứa tế bào đơn nhân gồm tế bào mono và lympho. Lớp màu trắng trong đĩ là dung d ch Ficoll và lớp cuối cùng là các tế bào hồng cầu
Hình 2.4: Máu ngoại chia làm 4 phần sau ly tâm với Ficoll
- Thu lớp tế bào đơn nhân: Sử dụng pipet hút lớp tế bào đơn nhân vào ống mới. Lưu ý hút vịng quanh và chậm để lấy được tồn bộ lớp tế bào đơn nhân tránh sục với lớp Ficoll phía dưới
- Rửa tế bào đơn nhân: Bổ sung PBS vào ống chứa tế bào đơn nhân đã thu để đạt thể tích 45ml mỗi ống và ly tâm 640×g trong 10 phút
- Sau ly tâm loại bỏ d ch nổi, bổ sung PBS để đạt thể tích 40ml mỗi ống, ly tâm 300×g trong 10 phút, thu tế bào dưới đáy ống
- Xác đ nh số tế bào đơn nhân: Nhuộm tế bào thu được với thuốc nhuộm Turck theo tỉ lệ 1:1 về thể tích và đếm trên buồng đếm tế bào. Số lượng tế bào được tính như sau:
MNC = 2 Thể tích (ml)
b) Phân lập tế bào Lympho T từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi
- Các tế bào đơn nhân thu được sau ly tâm được hịa tan trong dung d ch PBS chứa 0,5% FBS về thể tích tại 2-8oC theo tỷ lệ 80µl/107 tế bào
- Bổ sung 20µl CD4 và 20µl CD8 Microbead vào ống tế bào trên với tỷ lệ 20 µl/107 tế bào mix đều và ủ trong 15 phút tại 2-8oC
- Bổ sung thêm dung 2ml dung d ch đệm mix đều và ly tâm ống tế bào tại 300×g trong 10 phút. Lọai bỏ d ch nổi, thu cặn tế bào.
- Bổ sung dung d ch đệm để đạt mật độ 108 tế bào/500µl
- Nhỏ tồn bộ tế bào trên từ từ đi qua cột từ LS (Miltenyi Đức) được cố đ nh trên giá từ. Lưu ý: cột từ phải được rửa bằng dung d ch đệm rửa trước khi cho tế bào đi qua. Tại đây các tế bào được gắn marker CD4 và CD8 sẽ được giữ lại trên cột từ.
- Rửa cột bằng dung d ch rửa 3 lần (3ml/lần) để loại bỏ các thành phần bám trên cột từ khơng đặc hiệu.
- Đưa cột từ ra khỏi giá từ, nhỏ 5ml dung d ch rửa lên cột từ dùng pittong đẩy mạnh, d ch chảy qua là dung d ch chứa tế bào Lympho T cần phân tách.
- Ly tâm ống tế bào chứa tế bào Lympho T tại 270×g trong 8 phút, loại bỏ d ch nổi và thu cặn tế bào, sử dụng cho các bước thí nghiệm tiếp theo.
2.3.9. Đánh giá ảnh hƣởng của tế bào tua và Exsome lên sự sinh trƣởng của tế bào lympho T
- Tế bào Lympho T phân lập từ máu ngoại vi được nhuộm với thuốc nhuộm huỳnh quang carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE-Thermo Scientific) trước khi cảm ứng với DC và Exosome trong đĩa nuơi cấy 12 giếng với mật độ 5mM/106 tế bào.
- Tế bào Lympho T cảm ứng với DC/DCno theo tỷ lệ tế bào Lympho T:DC/DCno = 4:1 trong mơi trường KBM 551 chứa 50U/ml IL-2 với mật độ 6×105
tế bào/giếng. Lặp lại mỗi giếng 3 lần (Bảng 2.5)
- Exosome cũng được cảm ứng với cùng số lượng tế bào lympho T cảm ứng với DC/DCno theo tỷ lệ 1:4 về thể tích. Lặp lại mỗi giếng 3 lần (Bảng 2.5)
- Tế bào được nuơi cấy 4 ngày tại 37oC trong 5% CO2, bổ sung thêm 1/2 mơi trường ban đầu nuơi cấy mỗi hai ngày/lần.
- Kết thúc nuơi cấy đo cường độ tín hiệu huỳnh quang CFSE là cách chỉ th gián tiếp số lần phân chia tế bào Lympho T trên máy phân tích tế bào theo dịng chảy Navious
Bảng 2.5: Thiết kế thí nghiệm tế bào Lympho T cảm ứng với DC và Exosome trên đĩa 12 giếng
Đĩa 1:
Tcell-DC Tcell-DCno DC only Med
Tcell-DC Tcell-DCno DC only Med
Tcell-DC Tcell-DCno DC only Med
Đĩa 2:
Tcell-Exo Tcell-Exono Tcell only Tcell-Exo Tcell-Exono Tcell only Tcell-Exo Tcell-Exono Tcell only Trong đĩ:
Tcell-DC: Tế bào Lympho T đồng nuơi cấy với DC cảm ứng kháng nguyên
Tcell-DCno: Tế bào Lympho T đồng nuơi cấy với DC khơng cảm ứng kháng nguyên
Tcell-Exo: Tế bào Lympho T đồng nuơi cấy với Exo từ mơi trường nuơi cấy DC cĩ cảm ứng kháng nguyên
Tcell-Exono: Tế bào Lympho T đồng nuơi cấy với Exo từ mơi trường nuơi cấy DC khơng cảm ứng kháng nguyên
DC only: Mơi trường nuơi cấy chỉ chứa tế bào DC
Tcell only: Mơi trường nuơi cấy chỉ chứa tế bào Lympho T
2.3.10. Đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thƣ biểu mơ phế nang phổi A549 của tế bào lympho T đã cảm ứng
- Đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư của các tế bào lympho T sau cảm ứng với DC/DCno và Exo/Exono được thực hiện trên đĩa 96 giếng, thể tích mỗi giếng V=150µl
- Tế bào ung thư phổi A549 đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang Calcein-AM (DoJindo, Japan), cấy lên đĩa với mật độ ban đầu là 3.000 tế bào/giếng
- Tế bào lympho T sau khi cảm ứng với DC/DCno và Exo/Exono được bổ sung vào đĩa với các tỷ lệ tế bào lympho T/A549 lần lần là 12,5:1, 25:1, 50:1 trong mơi trường RPMI 1640. Mỗi tỷ lệ được lặp lại 3 lần.
- Sau thời gian 2 giờ ủ trong 37ºC, 5% CO2, tế bào được ly tâm tại 50×g, 2 phút. Hút bỏ 80µl mơi trường cũ bổ sung 80µl mơi trường mới mix đều sau đĩ ly tâm tại 50×g, 2 phút
Bảng 2.6: Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng gây độc tế bào A549 của tế bào Lympho T
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B Med Pos
Tcell-DC Tcell-DCno Tcell only
C Med Pos D Med Pos 50 25 12.5 50 25 12.5 50 25 12.5 E Tcell-Exo Tcell-Exono F Neg Neg G Neg Neg 50 25 12.5 50 25 12.5 H Trong đĩ:
Pos=positive control: Giếng chứa tế bào A549 trong mơi trường RPMI 1640 sau đĩ được bổ sung DCN90
Neg=negative control: Giếng chứa tế vào A549 trong mơi trường RPMI 1640
- Tỷ lệ chết của tế bào ung thư được xác đ nh bằng cường độ tín hiện huỳnh quang trước và sau khi ủ bằng máy đo huỳnh quang Terascan VPC2 (Minervatech - Nhật Bản) theo cơng thức:
% cytotoxicity =
x 100
2.3.11. Phƣơng pháp phân tích tế bào theo dịng chảy
- Tại thời điểm ngày 0, ngày 5, ngày 7 DC được xác đ nh tỷ lệ kháng nguyên bề mặt bằng các kháng thể gắn huỳnh quang và máy đếm dịng chảy tế bào bao gồm CD14, CD40, CD56, CD80, CD86, HLA-DR
- Tế bào Lympho T máu ngoại vi được phân tích các kháng nguyên bề mặt gồm CD3, CD4, CD8 (Miltenyi Biotec) sau khi phân lập bằng máy đếm dịng chảy tế bào - Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm FlowJo v.X.0.7
- Các bước tiến hành:
Chuẩn b tế bào: Ly tâm tế bào tại 300×g trong 5 phút, loại bỏ d ch nổi. Pha lỗng tế bào bằng PBS để đạt mật độ 106 – 3×106 tế bào/ml
Chuẩn b các ống chứa kháng thể như bảng 2.7
Bảng 2.7: Kháng thể sử dụng trong phƣơng pháp phân tích tế bào theo dịng chảy
(Ghi chú: KT - Kháng thể) Mẫu Ống IgG Ống 1 Ống 2 Ống 3 1. MNC phân lập từ máu xuống rốn 2. mDC Isotype control IgG1-FITC KT kháng HLA.DR-FITC Isotype control IgG1-PE KT kháng CD80- PE KT kháng CD40-PE KT kháng CD86-PE Isotype control IgG2a-PC7 KT kháng CD14- PC7 1. MNC phân lập từ máu ngoại vi Isotype control
Isotype control IgG1-FITC KT kháng CD8-FITC Isotype control IgG2a-PC7 KT kháng CD3-Vioblue
Thể tích 4µl mỗi loại 4µl mỗi loại 4µl mỗi loại 4µl mỗi loại
Bổ sung 100 μl tế bào vào mỗi ống chứa kháng thể, trộn đều và ủ trong tối 15-30 phút
Bổ sung dung d ch ly giải hồng cầu đối với mẫu MNC phân lập từ máu cuống rỗn trữ đơng và máu ngoại vi
Bổ sung vào mỗi ống chứa tế bào 2ml PBS 1X, trộn đều và ly tâm ở 300×g trong 5 phút, loại bỏ d ch nổi, thu tế bào.
Bổ sung 300μl PBS trộn đều và đưa các ống vào máy flow cytometry và chạy chương trình phân tích
2.3.12. Phƣơng pháp xử lý số liệu
- Kết quả dấu ấn bề mặt tế bào được phân tích bằng phần mềm Flowjo vX.07
- Các dữ liệu được phân tích theo phương pháp thống kê Student‘s t-test. Tr số p < 0,05 biểu th sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê.
Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả thu nhận protein tổng số từ dịng tế bào ung thƣ A549
- Thu nhận protein tổng số từ dịng tế bào ung thư A549 được thực hiện sau 10 chu kỳ làm lạnh trong nito lỏng và rã đơng trong bể ổn nhiệt 37oC, tiến hành nhuộm tế bào với trypan blue theo tỷ lệ 1:1 và kiểm tra dưới kính hiển vi để xác đ nh tỷ lệ sống chết. Kết quả quan sát thấy tỷ lệ chết của tế bào đạt 100%, tuy nhiên vẫn cịn một số tế bào chưa b phá vỡ màng
- Ly tâm để thu lấy d ch nổi chứa protein tổng số tế bào. D ch nổi được lọc qua màng lọc 0 2 µm để loại bỏ vi khuẩn và các yếu tố gây nhiễm, nếu cĩ.
- Tiến hành đo mật độ quang ở bước sĩng 595nm để lập đường chuẩn và tính nồng độ protein A549.
- Kết quả tách chiết protein tổng số trong 3 lần thực hiện thí nghiệm như sau:
Lần 1: 1,518 μg/ml
Lần 2: 1,910 μg/ml
Lần 3: 1,403 μg/ml
- Sau khi tách chiết, dung d ch protein được chia nhỏ vào các ống eppendorf 1,5ml và được bảo quản trong PBS ở -80 oC để sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.
- Một số nghiên cứu sử dụng peptide thương mại với mục đích cảm ứng kháng nguyên đặc hiệu với tế bào tua cũng như Exosome tiết từ tế bào tua.. Tuy nhiên liệu pháp này vẫn cịn một số nhược điểm như việc sử dụng các peptide thương mại khơng bao quát được hết các kháng nguyên ung thư cũng như khơng hoạt hĩa được các tế bào miễn d ch T và B. Một số nghiên cứu đã cho thấy chính các Dex cảm ứng với protein ung thư chứ khơng phải Dex cảm ứng bằng peptide, mới cĩ khả năng kích thích đáp ứng miễn d ch ở tế bào TCD4+ và tế bào B [45]. Vì vậy để khắc phục nhược điểm trên, trong nghiên cứu này các tế bào tua sẽ được cảm ứng với các protein ung thư thay vì các peptide ung thư.
3.2. Rã đơng máu cuống rốn trữ đơng
- Bốn mẫu máu cuống rốn trữ đơng được rã đơng tại các thời điểm khác nhau, sử dụng phương pháp ly tâm theo tỷ trọng với Ficoll để thu lớp Buffy coat. Tỷ trọng của Ficoll (1 077) cao hơn tỷ trọng của tế bào đơn nhân nhưng nĩ lại thấp hơn tỷ trọng của hồng cầu. Vì vậy, trong quá trình ly tâm, hồng cầu sẽ lắng xuống đáy ống ly tâm, tế bào đơn nhân sẽ nằm ở mặt trên lớp Ficoll. Số lượng tế bào đơn nhân sau khi phân lập từ máu cuống rốn trữ đơng được kiểm tra tỷ lệ sống chết bằng thuốc nhuộm Trypan Blue.
- Kết quả tỷ lệ tế bào sống ở các lần rã đơng máu cuống rốn như sau:
Lần 1: 24,29%
Lần 2: 22,06%
Lần 3: 37,7%
Lần 4: 27,6%
Sau khi rã đơng máu cuống rốn trữ đơng tỷ lệ tế bào sống đạt 27.9 6.9 %
- Kết quả tỷ lệ sống tế bào đơn nhân sau bốn lần rã đơng tương tự nhau, khoảng 30%. Tuy nhiên, kết quả này cịn tương đối thấp so với kết quả nghiên cứu trước đây của Antoniewicz-papis và cộng sự (2013) [6]. Quan sát màu sắc lớp Buffy coat sau ly tâm máu cuống rốn trữ đơng nhận thấy lớp này cĩ màu đỏ nhạt (Hình 2.4), là màu sắc của tế bào hồng cầu. Sự xuất hiện của tế bào hồng cầu (tế bào chết trong quá trình rã đơng) trong lớp Buffy coat làm tăng giả số lượng tế bào đơn nhân vì vậy giảm tỷ lệ sống tế bào thu được sau quá trình rã đơng.
3.3. Phân lập tế bào mono từ máu cuống rốn trữ đơng
- Tế bào đơn nhân MNC sau khi xác đ nh tỷ lệ sống chết được nhuộm với thuốc nhuộm Turck để xác đ nh số lượng tế bào. Dung d ch Turck chứa chất nhuộm màu tím gentian và 1-2% axit acetic, cĩ tác dụng phá hủy màng tế bào hồng cầu và bắt