tế bào mono(Monocyte-derived dendritic cell (moDC)) moDC người đã hoạt hĩa cĩ thể kích thích tế bào T CD8 ngoại vi trong in vitro, thể hiện khả năng kích thích nội sinh của Exosome [1]. Tuy nhiên trong trường hợp vắng DC, Exosome chỉ cĩ thể kích hoạt các tế bào T cảm ứng mà khơng phải các tế bào naive T. Ở chuột, kích hoạt tế bào T CD8 in vitro bằng Exosome mang phức hệ nhận diện peptide-MHC (peptide-MHC-
I complexes(pMHC-I)) được hỗ trợ bởi các tế bào DC. Hiệu quả miễn d ch của việc trình diện chéo bằng Exosome đã được thể hiện trong các thí nghiệm mà tại đĩ các pMHC-I vận chuyển bởi các Exosome phân lập từ mơi trường nuơi cấy DC người cĩ thể cung cấp cho DCnon khả năng trình diện các tế bào T CD8 đặc hiệu khối u ác tính trong chuột chuyển gen HLA-A2 [4]. Trình diện chéo MHC-I bằng Exosome nội bào hy vọng sẽ mang lại hiệu quả tốt nhất tại các v trí cĩ mật độ tế bào miễn d ch hoạt động cao, ví dụ như ở lách và hạch bạch huyết. Trạng thái Exosome được tiết ra từ DC cũng rất quan trọng, vì Exosome thu được từ DC trưởng thành cĩ thể kích thích sự tăng sinh tế bào T
CD8 in vitro và in vivo mạnh hơn so với Exosome từ DC chưa trưởng thành và hơn nữa
gây ra đáp ứng CTLs (cytotoxic T lymphocytes) đặc hiệu kháng nguyên, tế bào T CD8 nhớ và miễn d ch kháng khối u [27]. Thí nghiệm trên chuột vivo đã chứng minh rằng việc vận chuyển phức hệ pMHC-I chủ yếu xảy ra theo phương thức một chiều từ DC đến hạch lymph hay hoặc lá lách [3]. DC hoạt hĩa bởi kháng nguyên nội bào trong các mơ ngoại vi, trình diện chéo với phân tử MHC-I và di chuyển đến các mơ bạch huyết, là nơi tiết Exosome mang phức hệ pMHC và phân tử đồng kích thích để tương tác chéo hoặc DC di chuyển đến các mơ lympho gần nhất.
b) Khả năng trình diện kháng nguyên lớp MHC-II của Exosome cĩ nguồn gốc từ tế bào tua bào tua
Các thí nghiệm in vitro và in vivo đã chứng minh rằng Exosome được phân lập từ DC dung nạp kháng nguyên cĩ thể kích thích cả tế bào T CD4 cảm ứng và dịng tế bào
T CD4 nhưng kém hiệu quả trong việc kích thích tế bào nạve T [36]. Việc kích hoạt các tế bào nạve T CD4 phụ thuộc vào sự hiện diện DC trưởng thành và các phân tử đồng kích thích của CD80 và CD86 trên bề mặt DC cho thấy Exosome cĩ nguồn gốc DC cĩ thể khuếch đại đáp ứng tế bào T CD4 thơng qua trình diện chéo DC mà khơng tiếp xúc trực tiếp kháng nguyên [28]. Các nghiên cứu in vivo đã khẳng đ nh các Exosome tiết từ DC trưởng thành đã dung nạp kháng nguyên cĩ hiệu quả hơn trong việc bảo vệ, chống lại sự lây nhiễm so với Exosome tiết từ DCnon đã dung nạp kháng nguyên [17]. Hoạt hĩa, dung nạp kháng nguyên, sự di chuyển của DC đã chỉ ra rằng Exosome đi đến lá lách nơi DC tập trung, cĩ thể hoạt hĩa các tế bào T CD4. Exosome tiết từ DC hoạt hĩa giàu ICAM-1 (một phối tử cho integrin LFA-1 trên bề mặt các tế bào DC và T) giải thích lý do tại sao chúng hiệu quả hơn trong đáp ứng tế bào T so với Exosome tiết từ DCnon [28]. Các nghiên cứu in vivo đã chứng minh rằng Exosome được tiết từ DC cĩ thể tạo ra đáp ứng miễn d ch d ch thể [20]. Những báo cáo khác chỉ ra rằng các Exosome được tiết từ DC tiêm vào cơ thể cũng cĩ hiệu quả tương đương với các DC được dung nạp kháng nguyên trong cả đáp ứng miễn d ch d ch thể và đáp ứng miễn d ch tế bào chống lại kí sinh trùng Toxoplasmagondii [10]. Khi được chuyển đến DC, Exosome cĩ thể vẫn duy trì liên kết với màng tế bào hoặc dung hợp, tích hợp các protein màng và thành phần tế bào chất của Exosome vào các khoang tương ứng của tế bào nhận. Giả thiết cĩ lẽ được chứng minh một cách thuyết phục nhất là việc truyền miRNA từ Exosome cĩ thể ức chế các mRNA đích trong DC nhận. Tập hợp miRNA khác nhau được tích hợp vào Exosome từ DC chưa trưởng thành so sánh với DC trưởng thành được di chuyển đến DC điều chỉnh phản ứng miễn d ch [36].
Hình 1.9: Con đƣờng trình diện kháng nguyên của Exosome từ tế bào tua [37]
1: Qúa trình thực bào và nhập bào các tác nhân ngoại bào. 2, 3: Trình diện kháng nguyên chéo MHC lớp 1 theo con đường tế bào chất (2) hoặc khơng bào(3). 4: Hình thành phức hệ MHC lớp 2 trong bĩng nhập bào (endosome) và chuyển đến màng tế bào. 5: MV chứa phức hệ peptide MHC lớp 1 và 2 hình thành chồi trên màng tế bào chất. 6, 7: Sau khi hình thành chồi, MV duy trì sự gắn kết trên màng tế bào (6) hoặc giải phĩng ra mơi trường ngoại bào (7). 8: ILV mang phức hệ peptide MHC lớp 1 và 2 được hình thành trong các MVEs. 9: Exosome mang phức hệ peptide MHC lớp 1 và 2 được giải phĩng ra mơi trường ngoại bào khi xảy ra sự dung hợp giữa MVEs và màng tế bào. 10: Exosome cĩ thể duy trì gắn kết với màng tế bào. Viết tắt: ER, endoplasmic reticulum; ILV, intraluminal vesicle; MVE, multivesicular endosome.
1.4. Ứng dụng của tế bào tua và Exosome trong điều trị ung thƣ 1.4.1. Ứng dụng tế bào tua trong điều trị ung thƣ tại Việt Nam 1.4.1. Ứng dụng tế bào tua trong điều trị ung thƣ tại Việt Nam
Từ năm 1992 Steinman cùng với các đồng nghiệp ở châu Âu và Nhật Bản đã phát triển phương pháp để tạo ra một số lượng lớn các tế bào tua cho tới nay đã cĩ gần 100.000 báo cáo khoa học về tế bào tua với những kết quả cĩ ý nghĩa quan trọng về nghiên cứu và ứng dụng tr liệu đặc biệt là nhiều nghiên cứu về ứng dụng tế bào tua tr liệu ung thư. Tại Việt Nam, nhiều nhĩm nghiên cứu đã tiến hành nghiên cứu tế bào tua
bước đầu thử nghiệm trên động vật” do Viện Pasteur TP. HCM chủ trì và TS. Cao Th Bảo Vân là chủ nhiệm đề tài năm 2011. Bên cạnh đĩ liệu pháp miễn d ch tế bào tua này đã được tiến hành nghiên cứu thử nghiệm trên chuột mang ung thư vú tại Phịng thí nghiệm Nghiên cứu và ứng dụng Tế bào gốc (Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc gia TP.HCM). Kết quả cho thấy, khi khơng kết hợp với các phương pháp điều tr khác như phẫu thuật, hĩa tr hay xạ tr , việc ghép tế bào tua đã làm khối u vú của chuột giảm kích thước đến 87,5% so với khối u ban đầu. Ngồi ra, nghiên cứu của TS. Phạm Văn Phúc về ―Nghiên cứu phân lập và sử dụng tế bào miễn d ch (tế bào tua) trong điều tr ung thư vú‖ thực hiện trên mơ hình chuột người hĩa (humanized mouse model).Tuy nhiên, do tồn tại một số thách thức trong liệu pháp miễn d ch tế bào tua, gần đây các Exosome tiết từ tế bào tua được phát triển để sử dụng như là một cách thay thế trong liệu pháp vắc xin, khắc phục những khĩ khăn. (Bảng 1.2) [50]
Bảng 1.2: So sánh tiềm năng liệu pháp miễn dịch dựa trên DC và Dex
Dendritic cells (DC) DC-derived Exosome (Dex)
Xác đ nh thành phần phân tử
Thành phần phân tử cĩ thể thay đổi, khĩ xác đ nh trong kiểm tra chất lượng
Thành phần phân tử xác đ nh nghiêm ngặt ở mỗi bệnh nhân Sự biểu hiện phức hệ
peptide MHC lớp II bề mặt
Phức hệ peptide MHC lớp II bề mặt tế bào ít năng suất thấp
Giàu phức hệ peptide MHC lớp II bề mặt tế bào, gấp 10-100 lần so với DC.
Sự ổn đ nh vacxin Lưu trữ và ổn đ nh tế bào sống trong thời gian dài
Thành phần lipid của Dex cho phép ổn đ nh tế bào > 6 tháng tại -80°C
Kích thích miễn d ch tế bào NK
DC cĩ thể khơng biểu hiện đủ các phối tử thụ thể tế bào NK
Biểu hiện trên màng các phối tử thụ thể NK
Đáp ứng ức chế miễn d ch
Nhạy với các phân tử ức chế miễn d ch và điều hịa miễn d ch trong vi mơi trường khối u (7)
Khơng đáp ứng tới các phân tử ức chế miễn d ch
Vào năm 1996 báo cáo đầu tiên về Exosome được tiết từ tế bào lympho B cĩ thể trình diện hiệu quả các phức hệ peptide MHC lớp II (pMHC-II) cho các tế bào T CD4+ in vitro [66]. Sau đĩ Thery và đồng nghiệp phát hiện ra rằng khi tiêm Exosome cĩ gắn phức hệ pMHC-II vào chuột cũng tạo nên hiệu ứng in vivo, dẫn đến việc hoạt hĩa các tế bào T CD4 non đặc hiệu kháng nguyên [65]. Bên cạnh đĩ Zitvogel và đồng nghiệp (1998) đã chứng minh rằng các Exosome được tiết bởi tế bào tua cĩ nguồn gốc từ tủy xương mang các phân tử MHC-I, MHC-II và các phân tử đồng kích thích tế bào T [64]. Phân tử MHC-I trên Exosome tiết từ mơi trường nuơi cấy tế bào tua trình diện peptide đặc hiệu khối u, cĩ thể gây đáp ứng các tế bào lympho T gây độc đặc hiệu khối u và ức chế sự phát triển khối u trong cơ thể. Ba nghiên cứu mang tính bước ngoặt này đã tạo tiền đề cho nhiều cứu nghiên cứu về vai trị và ứng dụng của Exosome trong liệu pháp miễn d ch.
Việc sử dụng các Exosome cĩ nguồn gốc từ DC (thường được gọi là vắc-xin ung thư DExosome hoặc Dex) gần đây đã xuất hiện như một biện pháp thay thế cĩ thể vượt qua một số nhược điểm trong vắc-xin DC. Đầu tiên, thành phần phân tử Dex dễ xác đ nh hơn do đĩ tạo điều kiện xác đ nh chặt chẽ hơn về các thơng số kiểm sốt chất lượng. Dex cũng chứa một số lượng lớn các phức hệ MHC loại II-peptide mang lại hiệu suất cao. Khi so sánh với DC Dex cũng cĩ lợi thế lớn trong việc lưu trữ, với thời gian bảo quản dài đến 6 tháng khi trữ đơng -80 độ C [5].
Trong thập kỷ qua, một số thử nghiệm đánh giá tính khả thi, an tồn và hiệu quả của vắc-xin ung thư dựa trên Dex đã được thực hiện và kết quả nhìn chung rất đáng khích lệ. Vào năm 2016 Benjamin và cộng sự thực hiện thử nghiệm lâm sàng pha I sử dụng Exosome thu từ DC được trưởng thành bằng TLR4L hoặc Interferon IFN gamma trên 22 bệnh nhân NSCLC trong khoảng thời gian tháng 5/2010 đến tháng 4/2013 [11]. Kết quả cho thấy 22 bệnh nhân cĩ đáp ứng sau 4 lần truyền, thời gian sống khơng tiến triển (progression-free survival (PFS)) trung bình là 2.2 tháng. Trong số đĩ 7 trong 10 bệnh nhân trải qua 9 lần truyền được đánh giá cĩ PFS 4 tháng là 32%. Tỷ lệ sống tồn bộ (overall survial (OS)) tất cả bệnh nhân là 15 tháng. Một thử nghiệm khác được tiến hành trên chuột C57BL/6 vào năm 2018 bởi nhĩm nghiên cứu Shisheng Chen đã chứng
minh hiệu quả của Dex [16]. EV cĩ nguồn gốc từ DC tủy xương chuột kích thích tăng sinh tế bào T CD8+ cũng như giải phĩng cytokine IFN-y sau 48 giờ đồng nuơi cấy DC với T CD8+. Nhĩm nghiên cứu đã chứng minh khả năng gây độc đối với tế bào ung thư TC-1 (dịng ung thư biểu mơ phổi ở chuột) của T CD8+ sau khi ủ với EV đã qua xử lý với các kháng nguyên khác nhau. Sử dụng Dex tiêm vào tĩnh mạch chuột cho thấy khả năng sống kéo dài đáng kể cũng như sự tăng tiết IL-2 và IFN-y từ tế bào lách chuột so với mẫu đối chứng. Tiến hành tiêm thêm EV vào chuột cho thấy khả năng ức chế sự tăng trưởng khối u cũng như kéo dài tuổi thọ ở chuột.
1.5. Máu cuống rốn trữ đơng – nguồn cung cấp tế bào mono
Vào năm 1974 máu cuổng rốn đã được cơng bố là nguồn giàu tế bào gốc tạo máu và tế bào tiền thân được coi là giải pháp điều tr hữu ích cho các bệnh về di truyền, ung thư máu và suy giảm miễn d ch… Vào năm 1988 ca ghép máu cuống rỗn trữ đơng đầu tiên cho trẻ sơ sinh b mắc bệnh thiếu máu Fancoini được thực hiện tại Pháp [26]. Máu cuống rốn là máu cịn lại trong dây rốn và nhau thai sau khi sinh con, cĩ chứa tất cả các thành phần của máu gồm: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu và huyết tương. Đặc biệt, tỷ lệ quần thể tế bào mono trong máu cuống rốn đã được chứng minh tương tự với quần thể mono trong máu ngoại vi người trưởng thành, với tỷ lệ phần trăm tế bào CD14+CD16- trong monocyte lên tới 94%, so với 92% trong máu vi người trưởng thành [57]. Cho đến nay, một số lượng lớn nghiên cứu được cơng bố chứng minh tiềm năng tái sinh của các quần thể tế bào cĩ nguồn gốc từ máu cuống rốn, cùng với đĩ là hệ thống tồn cầu gồm 485 ngân hàng máu cuống rốn tại 97 quốc gia được thiết lập.
Liệu pháp vắc xin sử dụng exosome từ tế bào tua đã và đang được nghiên cứu trong các thử nghiệm lâm sàng.Việc phân lập các dexosome tự thân địi hỏi phải lấy một lượng máu lớn từ chính cơ thể người bệnh và các vắcxin tự cĩ thể khơng phát huy được hết khả năng của các tế bào miễn d ch do các cơ chế lẩn trốn miễn d ch của các tế bào ung thư trên cơ thể người bệnh.
Mỗi ngày cĩ hàng nghìn mẫu máu cuống rốn được sản xuất cĩ thể ứng dụng cho mục đích y tế. Vì vậy, máu cống rốn là nguồn máu sẵn cĩ để cung cấp tế bào mono cho liệuu pháp Dexosome, tuy nhiên, khĩ cĩ thể thu được các mẫu tươi đã phân lập vận
chuyển đến các đơn v cần sử dụng. Hơn thế nữa, việc sử dụng ghép tế bào gốc máu cuống rốn làm giảm khả năng đào thải do miễn d ch tăng cao sự tương thích HLA giữa người cho và người nhận [63]. Do đĩ việc thực hiện các bước phân lập, xử lý, bảo quản lạnh tế bào là bắt buộc để đảm bảo chất lượng tế bào trong nghiên cứu, thử nghiệm lâm
Chƣơng 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, chúng tơi lựa chọn bốn đơn v máu cuống rốn trữ đơng từ những người mẹ tình nguyện hiến tặng được lưu trữ trong tủ ni tơ hơi - ngân hàng máu cuống rốn trữ đơng - Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec trong khoảng thời gian từ tháng 1/2019 đến tháng 6/2019. Tất cả các mẫu máu được xử lý và thực hiện nuơi cấy tại Trung tâm Cơng nghệ cao - Bệnh viện đa khoa quốc tế Vinmec. Người mẹ đã được thơng báo đầy đủ về mục đích của nghiên cứu khi đồng ý hiến tặng mẫu máu cuống rốn theo bản: ―Tự nguyện chấp thuận tham gia hiến tặng mẫu sinh học‖ hình 2.2. Mẹ và trẻ sơ sinh đều khỏe mạnh và khơng nhiễm các virus gây bệnh như HIV HBV HCV HPV CMV… Mỗi một đơn v máu cuống rốn cĩ thể tích khoảng 25ml.
Bốn mẫu máu ngoại vi của người khỏe mạnh tình nguyện hiến tặng cũng được thơng báo đầy đủ về mục đích nghiên cứu. Mẫu máu ngoại v được thu thập độc lập tại Bệnh viện đa khoa Quốc tế Vinmec sau thời điểm rã đơng máu cuống rốn trữ đơng 7 ngày.
Hình 2.2: Bản tự nguyện chấp thuận tham gia hiến tặng mẫu sinh học tại Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec
2.2. Hĩa chất và thiết bị 2.2.1. Hĩa chất 2.2.1. Hĩa chất
Bảng 2.1 Hĩa chất sử dụng trong thí nghiệm
STT Tên hĩa chất Hãng sản xuất
1 Lymphocyte Serum-free Medium, KBM 551 Corning, China
2 DMEM Medium Gibco, Mỹ
3 Ficoll-Paque PLUS 1,077 mg/ml GE Healthcare Life Sciences, USA
4 Recombinant Human IL-2 Peprotech, USA
5 Recombinant Human GM-CFS Peprotech, USA
6 Recombinant Human IL-4 Peprotech, USA
7 Recombinant Human TNF-α Peprotech, USA
8 PBS (Phosphate Buffered Saline) Gibco, Mỹ
9 Turck Abliance, France
10 Trypan blue Gibco, Mỹ