b) Phân lập tế bào Lymph oT từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi
3.3. Phân lập tế bào mono từ máu cuống rốn trữ đơng
- Tế bào đơn nhân MNC sau khi xác đ nh tỷ lệ sống chết được nhuộm với thuốc nhuộm Turck để xác đ nh số lượng tế bào. Dung d ch Turck chứa chất nhuộm màu tím gentian và 1-2% axit acetic, cĩ tác dụng phá hủy màng tế bào hồng cầu và bắt màu với nhân của các tế bào bạch cầu. Vì vậy, MNC sẽ bắt màu tím, các tế bào hồng cầu khơng nhân khơng bắt màu thuốc nhuộm (hình 3.1)
Hình 3.1: Tế bào trên buồng đếm hồng cầu khi nhuộm với thuốc nhuộm Turck
Mũi tên đỏ: tế bào MNC bắt nhuộm thuốc màu tím; Mũi tên vàng: hồng cầu khơng bắt màu thuốc nhuộm; Mũi tên xanh: các mảnh vỡ xác tế bào hoặc tiểu cầu. - Số lượng MNC thu được kết quả như sau: (Bảng 3.1)
Bảng 3.1: Số lƣợng MNC thu đƣợc từ máu cuống rỗn trữ đơng
Mẫu Số lượng tế bào sống (× 106) Số lượng MNC (× 106) Tỷ lệ (%) MNC/tế bào sống 1 323 156 48,29 2 316 142 44,94 3 850 387 45,53 4 263 126 47,91
- Dựa theo kết quả thí nghiệm, MNC chiếm tỷ lệ từ 44 94% đến 48,29% trong tổng số tế bào lớp Buffy coat, cịn lại là một lượng lớn tế bào hồng cầu, quan sát rõ ràng trên buồng đếm tế bào (Hình 3.1)
- Gieo tế bào đơn nhân vào chai nuơi cấy với mật độ 2×106 tế bào/ml mơi trường KBM 551. Sau 2 giờ, thu tế bào bám dính và loại bỏ d ch nổi mơi trường nuơi cấy.
Dựa theo quan sát, một lượng lớn tế bào trơi nổi đã được loại bỏ là các tế bào lympho, hồng cầu và tế bào mono khơng bám dính. Phần tế bào quan sát trên chai nuơi cấy là các tế bào mono đã bám dính (Hình 3.2)
Hình 3.2: Tế bào đơn nhân trƣớc và sau khi loaị bỏ tế bào trơi nổi sau 2 giờ nuơi cấy
A: Tế bào đơn nhân nuơi cấy trước khi loại bỏ d ch nổi; B: Tế bào mono bám dính sau 2 giờ nuơi cấy được loại bỏ d ch nổi µ
- Để xác đ nh tỷ lệ phân lập tế bào đơn nhân bằng phương pháp bám dính tế bào đơn nhân trước và d ch nổi tế bào sau khi phân lập được phân tích dịng chảy tế bào (Flow cytometry). Dựa theo hai chỉ số: kích thước tế bào (forward scatter – FSC) và độ phức tạp nhân (side scatter – SSC), tỷ lệ tế bào mono bám dính được xác đ nh là hiệu số tế bào đơn nhân trước phân lập và tế bào đơn nhân từ d ch nổi mơi trường nuơi cấy (Hình 3.3) bằng phương pháp phân tích tế bào theo dịng chảy. Cụ thể, phần trăm tế bào mono được xác đ nh trước thời gian ủ 2 giờ trong mơi trường KBM 551 chiếm tỷ lệ cao hơn so với phần trăm tế bào mono cĩ trong d ch nổi tế bào.
- Hiệu suất phân lập tế bào mono qua quá trình phân lập bằng phương pháp bám dính là 35,8±11,3 (bảng 3.2) theo cơng thức:
Hình 3.3: Quần thể tế bào trƣớc và sau khi phân lập tế bào mono
Monocytes_pre: tế bào mono trước khi phân lập. Monocytes_post: tế bào mono từ d ch nổi tế bào
Bảng 3.2: Hiệu suất phân lập tế bào mono
GTTB: giá tr trung bình ĐLC: độ lệch chuẩn Mẫu Tỷ lệ tế bào mono trƣớc khi phân lập (%) Tỷ lệ tế bào mono dịch nổi tế bào (%)
Hiệu suất phân lập monocytes (%) 1 10,1 6,1 40,1 2 11.8 5.8 50,8 3 28,4 20,5 27,8 4 16,9 9,5 43,8 Trung bình (GTTB ĐLC) 19,0±8,5 11,9±7.6 35,8±11,3