b) Phân lập tế bào Lymph oT từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi
3.4. Kết quả biệt hĩa tế bào mono thành tế bào DC
3.4.1. Hình thái tế bào
- Tế bào mono trong quá trình nuơi cấy được quan sát hình thái ở 3 giai đoạn để thấy rõ sự thay đổi về hình dạng tế bào mono trong mơi trường biệt hĩa thành tế bào DC:
Giai đoạn 1: Ngày 1, sau khi phân lập tế bào mono
Giai đoạn 2: Ngày 6, sau 6 ngày nuơi cấy biệt hĩa tế bào mono thành DC chưa trưởng thành (iDC) (chưa bổ sung TNF-α) quan sát hình thái của DC, DCno và so sánh với tế bào mono.
Giai đoạn 3: Ngày 7, sau 7 ngày nuơi cấy biệt hĩa tế bào mono thành DC (bổ sung TNF-α) quan sát hình thái của DC/DCno và so sánh với iDC
- Tế bào mono là tế bào cĩ dạng hình cầu khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét sẽ thấy rõ các gờ trên bề mặt. Trong nghiên cứu này, khi quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi vào ngày 0, tế bào mono là các tế bào bám dính, cĩ dạng trịn, khơng cĩ màu kích thước khá đồng nhất đường kính trung bình 10µm (Hình 3.2B). Sau 3 ngày nuơi cấy tế bào trong mơi trường KBM 551 cĩ chứa GM-CSF và IL-4, một nửa mơi trường mới được bổ sung thay thế cho một nửa mơi trường cũ. Tại thời điểm này, xuất hiện tế bào lớn về kích thước khơng đồng đều ở cả bề mặt bám dính và trong d ch nổi. Sau 24 giờ tiếp theo, tế bào được bổ sung (hoặc khơng bổ sung) protein tổng số từ dịng tế bào ung thư biểu mơ phổi A549. Vào ngày thứ 6 dưới sự kich thích của protein đĩng vai trị là các kháng nguyên, tế bào được cảm ứng cĩ kích thước lớn hơn xuất hiện các tua ngắn đường kính khoảng 25µm là các DC chưa trưởng thành (Hình 3.4A). Tiếp tục bổ sung vào mơi trường nuơi cấy TNF-α. Tại ngày thứ 7, một lượng lớn tế bào xuất hiện dạng mỏng cĩ hai đuơi dài rõ rệt, trong khi một số tế bào xuất hiện hình thái với nhiều tua dài khơng đồng nhất như hình sao (Hình 3.4B 3.4C). Sau 24 giờ nuơi cấy dưới sự kích thích của TNF-α quá trình tưởng thành DC từ iDC thành mDC đã diễn ra với sự gia tăng về kích thước tế bào cũng như chiều dài các tua (trung bình từ 10-40µm).
Hình 3.4: Hình thái tế bào mono biệt hĩa thành tế bào DC
A: tế bào DCnon với kích thước lớn, tua ngắn (ngày thứ 6); B, C: tế bào DC trưởng thành vào ngày thứ 7 với (B) kích thước lớn, hai tua dài hoặc (C) kích
thước lớn, nhiều tua ngắn.
- Trong nghiên cứu này, DC biệt hĩa từ tế bào mono máu cuống rốn trữ đơng cĩ dạng mỏng đuơi dài tương tự như DC được mơ tả bởi Alia M. Aldahlawi và cộng sự miêu tả vào năm 2016 khi nuơi cấy tế bào trong mơi trường KBM 551 cĩ bổ sung GM-CSF và IL-4 [2]. Các tế bào hình sao đã được miêu tả ở những báo cáo trước trong nghiên cứu của Smita Nair, Hui-Jun Yi và Guang-Xiu Lu, Nowruz Delirezh và cộng sự [21, 44, 73]. Dựa trên các loại và nồng độ cytokine được sử dụng cũng như thời gian nuơi cấy, hình thái DC cĩ sự đa dạng khác nhau.
3.4.2. Các dấu ấn bề mặt tế bào
- Để xác đ nh sự biệt hĩa của tế bào đơn nhân thành tế bào tua, ngồi việc quan sát hình thái tế bào qua kính hiển vi, tại thời điểm nuơi cấy tế bào mono ngày đầu tiên, tế bào iDC ngày 6 và tế bào mDC ngày 7, tế bào được xác đ nh các dấu ấn bề mặt bởi các kháng thể bề mặt bao gồm CD14, CD80, HLA-DR, CD40, CD56, CD11c, CD123 bằng phương pháp phân tích tế bào theo dịng chảy (Hình 3.5B). Dựa vào hai chỉ số FSA và FSW để loại bỏ các tế bào chết và các tế bào kích thước lớn hơn tế bào đơn nhân. Sau đĩ phân biệt quần thể tế bào lympho và quần thể tế bào mono dựa vào chỉ số Forward scatter – FSC và Side scatter – SSC, quần thể tế đã cĩ sự thay đổi rõ rệt về kích thước cũng như độ phức tạp nhân (Hình 3.5A). Các tế bào
mono ngày D1 tập trung trong một vùng nhất đ nh trong khi đĩ quần thể tế bào ngày D7 phân bố rộng khơng đồng nhất.
Hình 3.5: Phân tích theo phƣơng pháp dịng chảy tế bào các dấu ấn bề mặt tế bào vào ngày D1, D6 và D7
Hình 3.5A: Tập hợp tế bào đơn được xác đ nh bằng hai chỉ số FSA và FSW và phân biệt tế bào lympho và tế bào mono bằng FSC và SSC. Hình 3.5B: Mức độ phần trăm biểu hiện các dấu ấn bề mặt lần lượt như: CD14, CD80, HLA-DR, CD40, CD56, CD86, CD11c, CD123. Viết tắt: CD: Cluster of differentiation.
- Dựa theo kết quả nghiên cứu, tỷ lệ trung bình các dấu ấn bề mặt được biểu hiện như bảng. So với tế bào mono ngày D1, iDC và mDC cho thấy sự gia tăng đáng kể trong biểu hiện của các dấu bề mặt như HLA-DR, CD11c, CD40, CD80 và CD86, giảm biểu hiện marker CD14 (dấu ấn bề mặt tế bào mono) và CD56 (dấn ấn bề mặt tế bào NK). Vào ngày D7, các tế bảo biểu hiện cao các dấu ấn CD40, CD80, CD86, HLA-DR và CD11c như bảng 3.3 . Kết quả này cũng tương tự như các kết quả của một số nghiên cứu khác [32].
Bảng 3.3: Giá trị trung bình các dấu ấn bề mặt biểu hiện trên tế bào tua ở giai đoạn nuơi cấy ngày (Đơn vị: %)
CD14 CD80 HLR-DR CD40 CD56 CD86 CD11c CD123
Day 1 4,78 2,37 19,02 11,6 8,2 4,47 1.02 1,56
Day 6_iDc 2,56 62,6 47,3 39,3 6,06 67,12 25,9 6,36
Day 7_mDc 1,55 80,4 79,2 41,9 5,31 80,6 40,9 8,21
- Xét về hình thái và kháng nguyên bề mặt DC đã được biệt hĩa thành cơng từ tế bào mono máu cuống rốn trữ đơng. Tuy nhiên hình thái và mức độ biểu hiện các marker bề mặt là khác nhau, tùy thuộc vào mơi trường nuơi cấy, yếu tố kích thích, và thời gian nuơi cấy. Ví dụ độ biểu hiện của HLA-DR trong quá trình biệt hĩa DC là cao hơn khi sử dụng đồng thời hai yếu tố kích thích TNF-α và MCM so với sử dụng TNF-α một mình [21]. Magdalena Szarynska đã chứng minh rằng nồng độ LPS hoặc IFN-γ được sử dụng càng cao thì mức độ biểu hiện CD80 càng lớn trong quá trình biệt hĩa và trưởng thành DC tế bào đơn nhân từ máu ngoại vi và máu cuống rốn [61].
Hình 3.6: Tỷ lệ trung bình các dấu ấn bề mặt.
Tế bào đơn nhân máu cuống rốn trữ đơng được nuơi cấy trong 7 ngày và phân tích bằng các dấu hiệu ấn bề mặt khác nhau bằng phương pháp tế bào học dịng chảy. Sai số chuẩn trung bình được biểu hiện trong mỗi cột
3.5. Kết quả phân lập tế bào lympho T từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi
- Tế bào mono máu ngoại vi người khỏe mạnh được phân lập dựa theo phương pháp ly tâm theo tỷ trọng bằng Ficoll. Từ tế bào mono, phân tách quần thể tế bào lympho T bằng bộ kit Microbeads Human KitMACS (Miltenyi Biotec, Inc., Germany) theo phương pháp lựa chọn dương tính hai dấu ấn bề mặt tế bào lympho là CD4 và CD8, để đánh giá mức độ tăng sinh độc tính của của tế bào Lympho T khi đồng nuơi cấy với các điều kiện kích thích khác nhau.
- Quần thể tế bào thu được sau khi phân tách bằng cột gắn từ được kiểm tra tỷ lệ sống chết và độ tinh sạch bằng phương pháp phân tích tế bào theo dịng chảy. Thuốc nhuộm 7-amino-actinomycin D (7AAD) dùng để phân biệt tỷ lệ sống chết của tế bào. Là một loại thuốc nhuộm huỳnh quang liên kết với DNA sợi đơi trong tế bào tại vùng giàu cặp bazo nito G-C, 7ADD bắt màu với tế bào chết do khơng bắt cặp DNA khi màng tế bào cịn nguyên vẹn. Sau đĩ các dấu ấn CD3 (dấu ấn đặc trưng cho tế
0 20 40 60 80 100 120 HLR-DR CD14 CD11c CD80 CD40 CD86 CD56 CD123 Tỷ lệ % tr un g bìn h biểu h iện d ấu ấ n bề m ặt Tỷ lệ trung bình dấu ấn bề mặt
bào Lympho T) CD4 CD8 được dùng để xác đ nh độ tinh sạch cũng như quần thể tế bào T gây độc (CTLs) và T bổ trợ (Th) trong tổng số tế bào thu được (Hình 3.7). - Theo kết quả phân tích từ nghiên cứu, quần thể tế bào lympho T cĩ độ tinh sạch rất
cao với tỷ lệ CD3 chiếm 98,7 ± 0,5%.
Hình 3.7 Phân tích quần thể tế bào lympho T bằng phƣơng pháp tế bào theo dịng chảy
Phân tích tế bào đơn dựa trên hai chỉ số FSA và FSH. Tỷ lệ tế bào sống sau đĩ được xác đ nh là các tế bào dương tính với 7-AAD trong quần thể tế bào Lympho. Các tế bào T CD4+ và CD8+ được phân biệt với nhau trong quần thể tế bào T CD3+. Các số hiển th trên hình ảnh là tỷ lệ phần trăm của quần thể tế bào.
3.6. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của tế bào tua và Exsome lên sự sinh trƣởng của tế bào lympho T tế bào lympho T
- Để xác đ nh khả năng kích thích tăng sinh tế bào lympho T của các Exosome phân lập từ mơi trường nuơi cấy DC và DCno, các tế bào lympho T máu ngoại vi người khỏe mạnh được nhuộm với thuốc nhuộm Carboxyfluorescein succinimidyl ester CFSE sau đĩ đồng nuơi cấy với các Exosome phân lập từ mơi trường nuơi cấy DC,
DCno máu cuống rốn trữ đơng. CFSE là thuốc nhuộm cĩ tính xuyên màng, khơng màu và khơng phát huỳnh quang khi nhĩm acetate được loại bỏ bởi các esterases nội bào trong các tế bào sống. Khi b phân cắt, CFSE liên kết cộng hĩa tr với nhĩm amin cĩ trong tế bào thơng qua nhĩm succinimidyl ester và phát tín hiệu huỳnh quang tại bước sĩng kích thích 490nm. CFSE tồn tại ở trong các tế bào sống và giảm một nửa tín hiệu huỳnh quang tại các thể hệ phân bào tiếp theo.
Hình 3.8: Sự tăng sinh tế bào lympho T CD3+ khi nhuộm CSFE.
Tế bào Lympho T được phân chia hai lần trong thời gian đồng nuơi cấy 7 ngày với DC đã được cảm ứng kháng nguyên A549 và phân chia một lần với DC khơng được cảm ứng với kháng nguyên (DCno) hoặc Exosome phân lập từ DC (Exo). Các tế bào Lympho T khơng được đồng nuơi cấy với DC/Exosome hoặc các tế bào Lympho T được ủ với các Exosome được phân lập từ mơi trường nuơi cấy DC khơng cảm ứng với kháng nguyên A549 (Exono) khơng phân chia. (T cell_DC: tế bào Lympho T đồng nuơi cấy với DC, T cell_DCno: tế bào Lympho T đồng nuơi cấy với DCno, T cell_Exo: tế bào Lympho T đồng nuơi cấy với Exo, T cell_Exono: tế bào Lympho T đồng nuơi cấy với Exono. T cell: tế bào Lympho T được nuơi cấy độc lập)
- Các phản ứng tăng sinh của các tế bào lympho T được xác đ nh bằng cách đo mật độ tín hiệu huỳnh quang (Fluorescence intensity FI) CFSE. Kết quả nghiên cứu cho thấy (Hình 3.8) các tế bào lympho T khi đồng nuơi cấy với DC cảm ứng với protein A549 (T cell_DC) cĩ tỷ lệ tăng sinh cao nhất, với sự phân chia lớn gấp hai lần trong 7 ngày nuơi cấy khi so sánh với các tế bào lympho T được ủ với DC khơng cảm ứng với protein A549 (Tcell_DCno). Các tế bào lympho T đồng nuơi cấy với Exosome phân lập từ DC (Tcell_Exo) cũng cĩ số lượng tế bào tăng sinh gấp 2 lần.
Tuy nhiên, khơng ghi nhận thấy sự phân chia khi quan sát các tế bào Lympho T nuơi cấy độc lập (Tcell), là các tế bào Lympho T khơng cĩ khả năng tăng sinh in vitro khi khơng cĩ sự kích thích.
- Kết quả sự tăng sinh tế bào lympho T đồng lồi trong cả hai trường hợp đồng nuơi cấy tế bào Lympho T với DC và DCno tương tự như báo cáo trước đây [25]. Qing Ge và cộng sự đã chứng minh rằng tế bào lympho T tăng sinh mạnh khi tỷ lệ đồng nuơi cấy với DC là 2,5: 1 hoặc 5:1. Hơn nữa Nowruz el đã chứng minh rằng DC cĩ thể kích thích các tế bào Lympho T đồng lồi bằng khả năng trình diện kháng nguyên của chúng, phù hợp với các đặc tính của DC như quá trình tiết ra các cytokine đáp ứng miễn d ch [9]. Sự tăng sinh gấp 2 lần ở nhĩm tế bào Lympho T đồng nuơi cấy với DC được kích thích kháng nguyên A549 (Tcell_DC) so với nhĩm lympho T đồng nuơi cấy với DC khơng được cảm ứng với kháng nguyên A549 (Tcell_DCno) đã chỉ ra rằng khả năng trình diện kháng nguyên của DC tốt hơn khi được cảm ứng với tác nhân lạ. Kết quả cũng tương tự như trong nghiên cứu cứu của Miwa và đồng nghiệp [67].
- Từ kết quả tăng sinh gần 2 lần tế bào lympho T khi đồng nuơi cấy với Exo tiết từ tế bào DC cĩ cảm ứng kháng nguyên (Tcell_Exo) so với tế bào lympho T khi đồng nuơi cấy với Exo tiết từ tế bào DC khơng cảm ứng kháng nguyên và tế bào Lympho T nuơi cấy độc lập, cĩ khả năng Exosome biểu hiện các kháng nguyên A549 lên bề mặt và kích thích sự tăng sinh tế bào lympho T khi trình diện các kháng nguyên đĩ, bao gồm cả tế bào tế bào lympho T CD4+ và CD8+. Kết cuả đồng quan điểm với Charlotte Admyre và cộng sự khi chứng minh sự tăng sinh của tế bào CD8+ khi được kích thích với Exosom tiết từ DC cĩ nguồn gốc từ tế bào mono cũng như kích thích tế bào CD4+ tốt hơn giữa Exosome tiết từ tế bào DC trưởng thành và DC chưa trưởng thành [1].
- Trong nghiên cứu này, DC và Exosome tiết từ DC cho thấy khả năng kích thích tăng sinh tế bào Lympho T, tuy nhiên số lượng Exosome thu được đến từ nhiều loại tế bào khác nhau tồn tại trong d ch nuơi cấy tế bào. Vì vậy, cần xác đ nh rõ tỷ lệ
Exosome cĩ khả năng trình diện kháng nguyên trong hỗn hợp thu được để xác đ nh cơng suất, tính hiệu kích thích tăng sinh tế bào Lympho T so với DC.
3.7. Kết quả đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thƣ biểu mơ phế nang phổi A549 của tế bào lympho T đã cảm ứng
- Khả năng gây độc tế bào của tế bào Lympho T được đánh giá dựa trên sự kháng lại các tế bào A549 được nhuộm với thuốc nhuộm Calcein - acetoxymethyl ester (Calcein-AM). Khi đi qua màng tế bào, nhĩm acetoxymethyl ester của thuốc nhuộm b thủy phân bởi các esterases nội bào, kích thích thuốc nhuộm phát hình quang. Mật độ huỳnh quang FI của Calcein tỷ lệ thuận với tỷ lệ tế bào sống.
- Kết quả trong nghiên cứu chỉ ra rằng cĩ sự giảm mức độ tín hiệu huỳnh quang đáng kể sau khi dịng tế bào A549 phản ứng với tế bào Lympho T đã được cảm ứng sau thời gian ủ trong 2 giờ (Hình 3.9). Trong nghiên cứu này, tế bào A549 được đồng nuơi cấy với tế bào lympho T tại các nồng độ khác nhau lần lượt là 1/12,5; 1/25; 1/50. Tỷ lệ gây độc tế bào của Lympho T đối với tế bào A549 được quy đổi thành biểu đồ tuyến tính từ mức độ tín hiệu huỳnh quang (Hình 3.10). Tại các tỷ lệ tế bào Lympho T so với tế bào ung thư A549 (E/T) càng cao thì tín hiệu giảm càng mạnh, chứng tỏ vài trị tiêu diệt tế bào A549 của tế bào T gây độc CD8+ tỷ lệ thuận với mật độ tế bào. Lympho T đồng nuơi cấy với DC cĩ cảm ứng kháng nguyên cho thấy khả năng gây độc tế bào tế bào A459 cao nhất. Trong khi đĩ gần như khơng cĩ sự khác biệt FI giữa tế bào Lympho T đồng nuơi cấy với Exosome từ mơi trường DC cảm ứng kháng nguyên (Exo) và DC khơng cảm ứng kháng nguyên (DCno) ở các tỷ lệ E/T thấp, ngoại trừ tỷ lệ E/T=50/1 cho thấy Lympho T đồng nuơi cấy với Exosome từ mơi trường DC cảm ứng kháng nguyên (Exo) cĩ khả năng tiêu diệt tế bào cao hơn DC khơng cảm ứng kháng nguyên (DCno). Cụ thể độc tính của tế bào lympho T đồng lồi được cảm ứng với DCno và Exo lần lượt là 37% và 50% khi tỷ lệ E/T=50/1, 31% và 26% khi E/T=25/1 và 26% và 13% khi E/T=12,5/1. Trong khi đĩ độc tính tế bào lympho T cảm ứng Exono cho