- Nội dung 5: Thử nghiệm hiệu quả phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây của các chủng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính enzyme AHL
2.3.6 Phương pháp thử nghiệm hiệu quả phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây của các chủng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính enzyme AHL
khoai tây của các chủng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính enzyme AHL lactonase trong điều kiện phòng thí nghiệm.
2.3.6.1 Vật liệu nghiên cứu:
- Củ khoai tây sạch bệnh
- Chủng VKNS có khả năng phân hủy AHLs - Chủng Ecc.
2.3.6.2 Phương pháp nghiên cứu:
Chuẩn bị lát cắt củ khoai tây
- Khử trùng bề mặt lát cắt khoai tây với cồn 70% trong 3 phút, tiếp theo NaClO (3% Cl-) + 1 - 2 giọt Tween 20 trong 5 phút. Tráng sạch bằng nước cất khử trùng 3 lần.
- Thấm khô bằng giấy thấm khử trùng. - Đặt mỗi lát cắt khoai tây vào mỗi đĩa Petri.
Chuẩn bị dịch vi khuẩn gốc:
- Chuẩn bị ống eppendorf (1.5ml) chứa 1000µl nước cất khử trùng. - Dùng que cấy lấy 1 - 2 đầu que cấy vi khuẩn (VKNS và vi khuẩn gây bệnh Ecc) đã nuôi trên môi trường YPDA tại 280C trong 24h cho vào ống nước cất, trộn kỹ trên máy vortex cho đến khi tạo thành dịch khuẩn đục (khoảng 108-109 cfu/ml)
Lây nhiễm
Phương pháp lây nhiễm được tiến hành như mô tả của Molina và cs (2003).
Cách 1: nhiễm trộn VKNS và Ecc
Ba lát cắt khoai tây cho mỗi chủng vi khuẩn thử nghiệm, đặt trong 3 đĩa Petri riêng biệt.
Chuẩn bị hỗn hợp dịch khuẩn VKNS và Ecc theo tỷ lệ 1:1. Trộn đều. Nhỏ 50 µl dịch khuẩn này lên giữa miếng khoai tây. Đối chứng âm: 50µl nước cất vô trùng. Đối chứng dương được thực hiện với hỗn hợp dịch khuẩn
Ecc và nước cất khử trùng theo tỷ lệ 1:1. Ủ mẫu trong 28oC và kiểm tra sau 24h.
Cách 2: nhiễm VKNS trước 24h và nhiễm Ecc sau
Đối chứng âm: 25µl nước cất vô trùng, sau 24h thêm 25µl nước cất vô trùng.
khuẩn Ecc.
Đĩa thí nghiệm: Nhỏ trước 25µl dịch VKNS và sau 24h sau tiến hành nhỏ tiếp 25µl dịch khuẩn Ecc vào thành lỗ khoan.
Ủ mẫu 28oC và kiểm tra sau lần nhiễm cuối cùng 24h.
Cách 3: nhiễm Ecc trước 24h và nhiễm VKNS sau
Đối chứng âm: 25µl nước cất vô trùng, sau 24h thêm 25µl nước cất vô trùng.
Đối chứng dương: 25µl dịch Ecc, sau 24h thêm 25µl nước cất vô trùng. Đĩa thí nghiệm: Nhỏ trước 25µl dịch Ecc và sau 24h sau tiến hành nhỏ tiếp 25µl VKNS vào thành lỗ khoan.
Ủ mẫu 28oC và kiểm tra sau lần nhiễm cuối cùng 24h.
Đánh giá kết quả thí nghiệm:
- Đọc kết quả sau 24h ủ ở 280C.
- Đánh số các đĩa 1,2,3 (mỗi chủng 3 đĩa)
- Cân từng miếng khoai tây đã lây nhiễm và ghi kết quả. - Rửa nhẹ dưới vòi nước chảy để loại bỏ hết phần thối.
- Cân lại trọng lượng lát cắt khoai tây sau khi rửa và ghi kết quả.
Phân tích kết quả:
Nhập kết quả trọng lượng lát cắt củ khoai tây vào Excel và tính trọng lượng của mô thối đã rửa.
Xử lý số liệu phân tích phương sai ANOVA bằng phần mềm Statview version 5.0.1 (SAS Institute Inc.) để tìm ra mức độ sai khác có ý nghĩa thống kê (P≤0,05) của trọng lượng mô thối của lát cắt khoai tây xử lý VKNS và không xử lý VKNS.