- Nội dung 5: Thử nghiệm hiệu quả phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây của các chủng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính enzyme AHL
2.3.5 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme AHLlactonase của các chủng VKNS phân hủy các loại AHLs tổng hợp C6, C8 và C10.
chủng VKNS phân hủy các loại AHLs tổng hợp C6, C8 và C10.
2.3.5.1 Vật liệu nghiên cứu:
- Chủng VKNS có khả năng phân hủy AHLs
- Chủng vi khuẩn chỉ thị: C. violaceum CV026; VIR07. - Hóa chất: AHL tổng hợp C6-HSL; C8-HSL; C10-HSL - Môi trường nuôi cấy: LB, YPD
2.3.5.2 Phương pháp nghiên cứu:
- Chủng vi khuẩn nội sinh được nuôi lắc trong các môi trường lỏng YPD chứa 10µM của mỗi loại AHL tổng hợp C6-HSL, C8-HSL hoặc C10-HSL ở 28oC trong 6h.
- C6-HSL và C8-HSL không phân hủy trong môi trường được xác định bằng cách bổ sung vi khuẩn chỉ thị C. violaceum CV026 và
chưa bị phân hủy hết. C10-HSL được xác định sử dụng chủng C.
violaceum VIR07.
- Hoạt tính enzyme AHL lactonase được xác được thông qua cơ chế tái tạo vòng lactone của các phân tử AHLs trong môi trường axit được tiến hành như sau:
+ 90µl của dịch nuôi cấy VKNS trong môi trường YPD có bổ sung 10µM C6-HSL hoặc C8-HSL hoặc C10-HSL tại 280C trong 6h được trộn với 10 µl dung dịch 1N HCl. Sau khi ủ ở 4oC trong 48h, 20 µl 1M Phosphate Buffer (pH 7.0) được bổ sung vào hỗn hợp để tạo môi trường trung tính.
+ Sự có mặt của phân tử AHL tái tạo lại vòng lactone trong môi trường axit được xác định bằng cách bổ sung chủng vi khuẩn chỉ thị
CV026/VIR07 và tiếp tục nuôi cấy lắc ở 30oC trong 24h.
- Nếu dịch nuôi cấy chuyển sang màu tím chứng tỏ vòng lactone của phân tử AHL được khôi phục và hoạt tính enzyme AHL lactonase của VKNS được xác định.