Phần 2 Tổng quan tài liệu
2.7. Thụ tinh nhân tạo cho chó
2.7.1. Sơ lược về quá trình giao phối và phóng tinh
Giao phối là chuỗi phản xạ không điều kiện, Bẩm sinh phức liên hoàn gồm hưng phấn, cương cứng, giao cấu, phóng tinh. Tiến trình này xảy ra khi con đực đã thánh thục. Phản xạ giao phối là một phản xạ mạnh của hệ thần kinh, nó ức chế các phản xạ khác. Ở chó trong mùa giao phối chó đực có thể đi hoang không cần ăn uống vì chó cái tiết ra một pheramon để hấp dẫn đồng loại, do đó chúng rất dễ gặp nhau trong mùa giao phối.
Khoảng thời gian chó đực được đưa đến trước chó cái và giao phối là rất biến đổi, nó phụ thuộc vào nhiều tác nhân. Tuy nhiên, chúng có những biểu hiện: Đầu tiên chó đực nhảy lên lưng chó cái và dập mạnh làm lộ ra một phần dương vật khỏi bao quy đầu, phóng một ít chất lỏng trong, đây chính là tinh thanh của pha thứ nhất, chứa rất ít tinh trùng. Khi giao phối dương vật chó không cần cương cứng vì trong dương vật chó có xương dương vật, nó tạo được độ cứng cần thiết để đưa dương vật vào âm đạo, trong giai đoạn này có một số cơ chế và những động tác cùng lúc. Trước hết, dương vật sưng lên, thể hổng dương vật chứa đầy máu, gây sự gia tăng về kích thước, đực biệt là tuyến hành dương vật, nó tạo thành khối hình cầu trên thân dương vật, đồng thời có sự co thắt cả vách âm đạo và âm môn, giúp dương vật bị khoá chặt trong đường sinh dục chó cái. Cũng trong thời gian này chó đực sẽ phóng tinh lần hai, lần này rất nhiều tinh trùng. Thể tích tinh của pha này biến đổi từ 0,5-2 ml và được lưu giữ ở phía trước của âm đạo chó cái, gần nhưng chưa tới cổ tử cung. Do chó đực không có khả năng giữ cơ thể của nó lâu trên lưng chó cái nên xảy ra hiện tượng “dính lẹo”. Thời gian “dính lẹo” có thể kéo dài từ 0,5-1 giờ, trong thời gian này sẽ diễn ra quá trình phóng tinh pha thứ ba. Việc giao phối có thành công hay không không liên quan đến thời gian “dính lẹo” vì thời gian này ở những chó khác nhau là rất khác nhau.
2.7.2. Các chu kỳ động dục của chó cái
Chu kỳ động của chó cái được nghỉ ngơi chia làm 4 giai đoạn: Trước động dục, động dục, sau động dục và nghỉ ngơi. Theo Feldman and Nelson (1996), khoảng thời gian của các chu kỳ động dục tuỳ theo giống, điều kiện chăm sóc, quản lý, dinh dưỡng và bệnh lý.
Giai đoạn trước động dục
Được xác định khi có dấu hiệu sưng phồng và tiết dịch ở âm hộ đến khi nó cho phép chó đực chồm nhẩy và giao phối. Trong giai đoạn này chó cái có những dấu hiệu như: âm hộ sưng đỏ, chảy máu và tiết dịch. Giai đoạn này kéo dài từ 6 đến 11 ngày, thương là 9 ngày, nhưng cũng có thể chỉ 2 ngày và cũng có thể kéo dài 25 ngày.
Giai đoạn động dục
Đây là giai đoạn chịu đựa của chó cái, nó cho phép chó đực chồm nhảy và giao phối, lúc này có thể coi là ngày đầu tiên của giai đoạn động cụ, âm hộ giảm sưng, trở nên mềm nhăn da, dịch tiết có màu hống lợt, hơi dẻo và trong. Giai đoạn này kéo dài từ 3 đến 21 ngày, trung bình là 9 ngày, nhưng cũng có khi chỉ xảy ra 1-2 ngày hoặc kéo dài 18-20 ngày, vì thế rất khó xác định thoòi gian động
Giai đoạn sau động dục
Nếu giai đoạn động dục không được phối hay phối không đậu thì tiếp theo sẽ là giai đoạn này. Được xác định từ khi chó cái chấm dứt giai đoạn động dục đứng ỳ, giai đoạn này kéo dài khoảng 56-58 ngày nếu chó mang thai hoặc 60-100 ngày nếu chó không mang thai. Thường thì thời gian này kéo dài 2 tháng.
Giai đoạn nghỉ ngơi
Kể từ khi chấm dứt giai đoạn sau động dục đến khi bắt đầu giai đoạn trước động dục tiếp theo, thực tế rất khó xác định giao điểm của giai đoạn sau động dục và giai đoạn nghỉ ngơi, đây là giai đoạn yên tĩnh giữa tuyến não thuỷ và buồng trứng, giai đoạn này kéo dài 4,5 tháng.
Tóm lại, chu kỳ động dục bình thường của một chó cái diễn ra như sau: giai đoạn trước động dục kéo dài 9 ngày, giai đoạn động dục kéo dài 7-9 ngày, giai đoạn sau động dục kéo dài 58 ngày, nghỉ ngơi khoảng 4,5 tháng.
2.7.3. Thụ tinh nhân tạo.
2.7.3.1. Xác định thời điểm phối giống thích hợp
Thời điểm phối giống thích hợp sẽ năm trong giai đoạn động dục, cụ thể là thời gian mê đực, sự xuất noãn sẽ sảy ra sau 48 giờ kể từ thời điểm bước qua giai đoạn động dục. Trên chó để xác định thoòi điểm phối giống thương dựa vào các phương pháp:
- Phương pháp lâm sàng : Dựa vào biểu hiện như dịch tiết ở âm hộ lợt màu, dẻo trong, âm hộ mễm nhẵn da, có biểu hiện mê đực, đứng im cho chó đực chồ nhảy và chấp nhận phối giống.
- Phương pháp phi lâm sàng:
+ Dựa vào sự biến đổi của tế bào biểu mô ở âm đạo: Theo Olson (1982), trong giai đoạn động dục thì trên tiêu bản vết phết dịch âm đạo có đến 90% tế bào bề mặt, 5% tế bào gốc, có nhiều vi khuẩn hiện diện tấn công vào tế bào bề mặt.
+Dựa vào máy xác định thời điểm rụng trứng Dramisnski: nguyên tắc hoạt động của máy là đo hàm lượng estrogen trong dịch tiết âm hộ chó cái trong giai đoạn trước động dục và động dục.
2.7.3.2. Thụ tinh nhân tạo sử dụng tinh đông lạnh
Thụ tinh nhân tạo chó bằng tinh đông lạnh trên đá nitơ khô đã thu được kết quả cách đây ba mươi năm Seager (1977). Tuy nhiên tỷ lệ thụ thai thấp hơn so với tinh nguyên (Linde and Forsberg, 1991). Silva (1996), cho rằng: thụ tinh
nhân tạo chó bằng tinh nguyên hoặc tinh đông lạnh, chó cái được thụ tinh kép vào ngày thứ 3 và ngày thứ 5 sau khi xác định được đỉnh của LH. Tổng thể tích tinh dịch để phối giống đối với thụ tinh âm đạo là 5ml, đối với thụ tinh dạ con là 2ml. Chó cái được thụ tinh bằng tinh đông lạnh đạt tỷ lệ thụ thai là 60%, chó được thụ tinh với tinh tươi đạt tỷ lệ thụ thai là 100%. Fontbonne (1993), đã so sánh hai phương pháp thụ tinh âm đạo và thụ tinh dạ con cho chó bằng tinh đông lạnh, kết quả cho thấy thụ tinh dạ con cho tỷ lệ thụ tinh (75,3%) cao hơn có ý nghĩa so với thụ tinh âm đạo (52,6%) (Đỗ Văn Thu, 2010). Linde and Forsberg (1993), thụ tinh cho chó bằng tinh tươi và thụ tinh âm đạo, thụ tinh bằng tinh đông lạnh và thụ tinh dạ con. Tỷ lệ thụ thai đối với tinh nguyên và tinh đông lạnh tương ứng là 54,7% và 39%. Nếu xác định được chính xác chu kỳ động dục, các tỷ lệ này là 62,3% và 51,1%. Tỷ lệ thụ thai ở chó cho phối tự nhiên cao hơn thực sự (88,6%) so với thụ tinh nhân tạo bằng tinh tươi. Tỷ lệ thụ thai và số con trong một lứa tăng lên khi phối giống kép so với phối đơn. Farstad (1989), đã tiến hành thụ tinh nhân tạo chó với tinh đông lạnh, hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh đạt 60%, thụ tinh đơn và thụ tinh kép với khoảng cách hai lần là 01 - 02 ngày, kết quả thu được cho thấy: tỷ lệ thụ thai khi được thụ tinh đơn thấp hơn so với thụ tinh kép (64% so với 69%). Việc xác định đúng thời điểm thụ tinh là cần thiết cho thụ thai khi thụ tinh với tinh đông lạnh. Tsutsui (2000), nghiên cứu thụ tinh nhân tạo sử dụng tinh đông lạnh. Tinh dịch được đông lạnh trong môi trường có chứa 7% glycerol và 0,7% Orvus ES Paste (OEP). Thụ tinh nhân tạo trong dạ con có tỷ lệ thụ thai cao (90%), số con trung bình/lứa: 3,6. Chó cái được thụ tinh sử dụng tinh đông lạnh mà trong môi trường không được bổ sung OEP đều không thụ thai. Khi thụ tinh âm đạo với các nồng độ khác nhau thấy rằng nồng độ tinh trùng 20.106 có thể đạt được sự thụ thai. Nhưng tốt nhất là thụ tinh trong dạ con bằng tinh đông lạnh mà trong môi trường có bổ sung OEP. Linde and Forsberg (1999), đã tiến hành thụ tinh nhân tạo trong tử cung trên 167 chó và thụ tinh âm đạo trên 141 chó. Tỷ lệ đẻ sau khi thụ tinh nhân tạo trong tử cung đạt 84,4% cao hơn hẳn so với thụ tinh âm đạo (58,9%). Số con/lứa cũng có sự khác nhau thực sự, đạt 5,4 - 3,0 con /lứa khi thụ tinh tử cung và đạt 4,0 - 2,7 con/ lứa khi thụ tinh âm đạo. Thomassen (2001), đã thử nghiệm thụ tinh nhân tạo cho chó bằng tinh đông lạnh trên 312 con, thuộc 70 giống khác nhau (183 liều tinh nhập ngoại và 129 liều tinh sản xuất trong nước) thu được tỷ lệ đẻ 70%, số con trung bình một lứa là 5,3 con. Thụ tinh trong cổ tử cung kết quả tỷ lệ đẻ (71%) cao hơn thụ tinh trong âm đạo (29%). Thời điểm thụ tinh chính xác sẽ cho tỷ lệ đẻ và số con trong
một lứa cao hơn. Thụ tinh kép cho tỷ lệ đẻ và số con trong một lứa cao hơn thụ tinh đơn. Tinh đông lạnh có hoạt lực tinh trùng thấp hơn 50% hoặc tỷ lệ kỳ hình lớn hơn 20% cho tỷ lệ thụ tinh thấp. Tinh đông lạnh có hoạt lực tinh trùng lớn hơn 50% và tỷ lệ tinh trùng kỳ hình thấp hơn 20% thu được tỷ lệ mang thai cao hơn. Pinto (1999), đã tiến hành thụ tinh nhân tạo chó bằng tinh bảo quản lạnh (bảo quản ở 50C), kết quả đạt được 95% chó cái thụ tinh; số con trung bình một lứa là 7,1, kết quả này không khác nhau so với thụ tinh nhân tạo bằng tinh nguyên.
2.8. TÌNH HÌNH PHÁT TRİỂN VÀ SỬ DỤNG CHÓ MALİNOİS TẠİ VİỆT NAM
Chó Malinois mới được nhập khẩu, nuôi dưỡng và huấn luyện ở nước ta khoảng 4 năm gần đây. Sau một thời gian, chó Malinois được đánh giá là thích hợp cao với điều kiện của Việt Nam. Hiện nay, nhu cầu sử dụng chó Malinois tại các đơn vị an ninh, quốc phòng là tương đối lớn. Tuy nhiên, giá thành nhập khẩu của giống chó này tương đối cao, đồng thời mất nhiều chi phí cho việc nuôi thích nghi sau khi nhập về.
Hiện nay, tại Cục Cảnh sát quản lý, huấn luyện và sử dụng động vật nghiệp vụ (K204) – Bộ Công an đang nuôi dưỡng một đàn Malinois thuần chủng. Ở ngoài dân, cũng có 1 số lượng lớn chó Malinois được nuôi dưỡng sử dụng cho việc bảo vệ và làm kinh tế. Tuy nhiên, do chưa có một hệ thống nhân giống theo quy hoạch, việc nuôi dưỡng tự phát và phối giống thiếu kiểm soát đã làm mất đi những đặc điểm, khả năng vốn có của giống chó này.
Với vai trò quan trọng của chó Malinois nói riêng và chó nghiệp vụ nói chung, trong thời gian vừa qua, Phòng sinh học tế bào sinh sản, Viện Công nghệ Sinh học đã được giao nhiệm vụ thực hiện đề tài: “Nghiên cứu công nghệ bảo tồn tinh dịch và thụ tinh nhân tạo chó nghiệp vụ của ngành Công an” và “Ứng dụng công nghệ bảo tồn tinh dịch và thụ tinh nhân tạo chó để nhân giống và bảo tồn một số giống chó nghiệp vụ của ngành Công an” do tiến sĩ Đỗ Văn Thu làm chủ nhiệm. Kết quả của 2 đề tài trên đã bảo tồn được tinh dịch ở dạng pha loãng và đông lạnh, thành công trong thụ tinh nhân tạo chó góp phần phát triển đàn chó có chất lượng cao phục vụ cho công tác an ninh và Quốc phòng.
Tuy nhiên, công nghệ đông lạnh tinh dịch chó hiện nay vẫn được áp dụng chung trên tất cả các giống chó nghiên cứ như: Berger (Đức), Labrado, Cooker, Phú Quốc... Do vậy, việc có được công nghệ đông lạnh tinh dịch dành riêng cho giống chó Malinois việc làm rất cần thiết.
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
+ Cục Cảnh sát quản lý, huấn luyện và sử dụng động vật nghiệp vụ (K204) – Bộ Công an.
+ Phòng sinh học tế bào sinh sản – Viện công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU Từ tháng 6/2015 – 6/2016 Từ tháng 6/2015 – 6/2016 3.3. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Chó Malinois nuôi tại Cục Cảnh sát quản lý, huấn luyện và sử dụng động vật nghiệp vụ (K204) – Bộ Công an.
Sử dụng 07 chó Malinois đực và 10 chó Malinois cái. Chó đực trong độ tuổi từ 1,5 – 3 tuổi, khỏe mạnh; chó cái từ 2 - 3 tuổi, đã đẻ 1 – 2 lứa, khỏe mạnh.
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.4.1. Đánh giá một số chỉ tiêu sinh học và tính chất lý hóa học của tinh dịch chó Malinois chó Malinois
- Nghiên cứu một số đặc điểm tinh dịch: lượng tinh dịch, hoạt lực của tinh trùng, nồng độ tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng sống, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình, tổng số tinh trùng tiến thẳng trong lần lấy tinh.
- Nghiên cứu tính chất lý - hóa học tinh dịch: áp lực thẩm thấu, năng lực đệm, độ nhớt, tỷ trọng, pH tinh dịch.
3.4.2. Nghiên cứu công nghệ đông lạnh tinh dịch chó Malinois và ứng dụng sản xuất tinh chó đông lạnh bảo tồn ở -196C sản xuất tinh chó đông lạnh bảo tồn ở -196C
3.4.2.1. Nghiên cứu về môi trường
- Nghiên cứu một số tính chất lý - hóa học của môi trường đông lạnh: áp lực thẩm thấu, năng lực đệm, độ nhớt, tỷ trọng, pH môi trường.
- Ảnh hưởng của môi trường đông lạnh lên chất lượng tinh đông lạnh
- Nghiên cứu ảnh hưởng của Glycerol và DMSO lên chất lượng tinh đông lạnh.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Glycerol lên chất lượng tinh đông lạnh
- Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung phần môi trường có glycerol lên chất lượng tinh đông lạnh.
3.4.2.2. Ảnh hưởng của thời gian ủ tinh dịch và tốc độ đông lạnh giải đông lên chất lượng tinh đông lạnh
- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh lên chất lượng tinh đông lạnh.
- Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh lên chất lượng tinh đông lạnh.
- Nghiên cứu tốc độ giải đông (nhiệt độ và thời gian) tinh chó đông lạnh. 3.4.3. Sản xuất tinh chó Malinois đông lạnh
3.4.3.1. Đánh giá chất lượng tinh chó Malinois đông lạnh trong quá trình bảo tồn ở -1960C
- Đánh giá chất lượng tinh chó Malinois đông lạnh trong thời gian bảo tồn ở - 1960C thông qua các chỉ tiêu: hoạt lực của tinh trùng, sức sống của tinh trùng sau giải đông và ủ ở 37C, tỷ lệ tinh trùng sống, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình.
3.4.3.2. TTNT cho chó Malinois để thử nghiệm tinh đông lạnh sản xuất được
- Thụ tinh nhân tạo cho chó bằng tinh đông lạnh.
- Đánh giá khả năng sinh sản của chó cái được TTNT. 3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp lấy tinh
Sau khi xem xét, lựa chọn chó Malinois đực đạt yêu cầu, tiến hành khai thác tinh dịch. Trong quá trình khai thác tinh dịch không cho chó đực giao phối trực tiếp ít nhất là 03 ngày trước thời điểm lấy tinh. Thời gian khai thác tinh vào buổi sáng, tinh dịch được khai thác bằng phương pháp massage trong một không gian yên tĩnh.
Quá trình khai thác tinh gồm các bước sau:
- Kích thích ở phần tự do của quy đầu cho đến khi nó xuất ra chất dịch trong (tinh thanh), đó là pha thứ nhất của quá trình xuất tinh.
- Khi chó đực bắt đầu dập mạnh để chuẩn bị xuất tinh ở pha thứ hai thì thôi không kích thích nữa mà phải bóp chặt, tạo một áp lực mạnh ở tuyến hành dương vật để xuất toàn bộ tinh dịch của pha này.
- Sau khi chó đực xuất hết tinh thì tiếp tục kích thích cho đến khi tinh thanh ra hết, mục đích là giúp rửa sạch lòng dương vật của chó đực.