Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.4. Nội dung nghiên cứu
3.4.1. Đánh giá một số chỉ tiêu sinh học và tính chất lý hóa học của tinh dịch chó Malinois chó Malinois
- Nghiên cứu một số đặc điểm tinh dịch: lượng tinh dịch, hoạt lực của tinh trùng, nồng độ tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng sống, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình, tổng số tinh trùng tiến thẳng trong lần lấy tinh.
- Nghiên cứu tính chất lý - hóa học tinh dịch: áp lực thẩm thấu, năng lực đệm, độ nhớt, tỷ trọng, pH tinh dịch.
3.4.2. Nghiên cứu công nghệ đông lạnh tinh dịch chó Malinois và ứng dụng sản xuất tinh chó đông lạnh bảo tồn ở -196C sản xuất tinh chó đông lạnh bảo tồn ở -196C
3.4.2.1. Nghiên cứu về môi trường
- Nghiên cứu một số tính chất lý - hóa học của môi trường đông lạnh: áp lực thẩm thấu, năng lực đệm, độ nhớt, tỷ trọng, pH môi trường.
- Ảnh hưởng của môi trường đông lạnh lên chất lượng tinh đông lạnh
- Nghiên cứu ảnh hưởng của Glycerol và DMSO lên chất lượng tinh đông lạnh.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Glycerol lên chất lượng tinh đông lạnh
- Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung phần môi trường có glycerol lên chất lượng tinh đông lạnh.
3.4.2.2. Ảnh hưởng của thời gian ủ tinh dịch và tốc độ đông lạnh giải đông lên chất lượng tinh đông lạnh
- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh lên chất lượng tinh đông lạnh.
- Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh lên chất lượng tinh đông lạnh.
- Nghiên cứu tốc độ giải đông (nhiệt độ và thời gian) tinh chó đông lạnh. 3.4.3. Sản xuất tinh chó Malinois đông lạnh
3.4.3.1. Đánh giá chất lượng tinh chó Malinois đông lạnh trong quá trình bảo tồn ở -1960C
- Đánh giá chất lượng tinh chó Malinois đông lạnh trong thời gian bảo tồn ở - 1960C thông qua các chỉ tiêu: hoạt lực của tinh trùng, sức sống của tinh trùng sau giải đông và ủ ở 37C, tỷ lệ tinh trùng sống, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình.
3.4.3.2. TTNT cho chó Malinois để thử nghiệm tinh đông lạnh sản xuất được
- Thụ tinh nhân tạo cho chó bằng tinh đông lạnh.
- Đánh giá khả năng sinh sản của chó cái được TTNT. 3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp lấy tinh
Sau khi xem xét, lựa chọn chó Malinois đực đạt yêu cầu, tiến hành khai thác tinh dịch. Trong quá trình khai thác tinh dịch không cho chó đực giao phối trực tiếp ít nhất là 03 ngày trước thời điểm lấy tinh. Thời gian khai thác tinh vào buổi sáng, tinh dịch được khai thác bằng phương pháp massage trong một không gian yên tĩnh.
Quá trình khai thác tinh gồm các bước sau:
- Kích thích ở phần tự do của quy đầu cho đến khi nó xuất ra chất dịch trong (tinh thanh), đó là pha thứ nhất của quá trình xuất tinh.
- Khi chó đực bắt đầu dập mạnh để chuẩn bị xuất tinh ở pha thứ hai thì thôi không kích thích nữa mà phải bóp chặt, tạo một áp lực mạnh ở tuyến hành dương vật để xuất toàn bộ tinh dịch của pha này.
- Sau khi chó đực xuất hết tinh thì tiếp tục kích thích cho đến khi tinh thanh ra hết, mục đích là giúp rửa sạch lòng dương vật của chó đực.
Chú ý: người khai thác tinh chỉ dùng lọ hứng phần tinh dịch của pha thứ hai của quá trình phóng tinh (vì pha này chứa nhiều tinh trùng) còn những pha khác thì bỏ qua.
3.5.2. Phương pháp nghiên cứu sinh học tinh dịch chó 3.5.2.1. Lượng tinh dịch (V) 3.5.2.1. Lượng tinh dịch (V)
Theo phương pháp của Chemineau (1991), xác định thể tích tinh dịch qua ống hút pipet thuỷ tinh có chia độ hoặc xác định qua phễu hứng tinh đã chia độ, đặt lọ thuỷ tinh trên mặt phẳng nằm ngang và đọc kết quả ở vạch cong dưới của mặt tinh dịch.
3.5.2.2. Hoạt lực tinh trùng (A)
Theo phương pháp của Chemineau (1991), sức hoạt động được tính bằng tỷ lệ % tinh trùng có hoạt động tiến thẳng so với tổng số tinh trùng có trong vi
3.5.2.3. Nồng độ tinh trùng (C)
Theo phương pháp của Chemineau (1991), dùng buồng đếm hồng cầu và bạch cầu (kiểu Neubouer) và ống pha loãng hồng cầu. Pha loãng tinh dịch 100 - 200 lần bằng dung dịch NaCl 3% (hút tinh dịch đến vạch 0,5 - 1,0 rồi hút NaCl 3% đến vạch 101).
3.5.2.4. Tổng số tinh trùng tiến thẳng (V.A.C)
Theo John B.Herrick and Self (1962), tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần lấy tinh = lượng tinh dịch (ml) x nồng độ tinh trùng/ml x hoạt lực tinh trùng tiến thẳng (%) (Đỗ Văn Thu, 2010).
3.5.2.5. Tỷ lệ tinh trùng sống (LS)
Theo phương pháp của Chemineau (1991).
Dung dịch nhuộm: Eosin: 1g; Nigrosin: 2g; Natri – citrate: 5,5g; H20: 3,57g; nước cất 2 lần: 100 ml.
pH dung dịch nhuộm: 6,7 - 6,8; áp suất thẩm thấu 310 miliosmol/kg. 3.5.2.6. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K)
Theo phương pháp của William (1921), kết hợp vơi phương pháp Cheminau (1991) (Đỗ Văn Thu, 2010).
3.5.3. Nghiên cứu môi trường bảo tồn 3.5.3.1. Xác định pH 3.5.3.1. Xác định pH
Đo bằng giấy đo pH của Trung Quốc hoặc máy đo pH Mettler 320. 3.5.3.2. Áp lực thẩm thấu (posm)
Đo bằng máy đo áp lực thẩm thấu (Osmometre), đơn vị: miliosmol/kg 3.5.3.3. Tỷ trọng (d) Dùng bình đo tỷ trọng (picrometre). Công thức tính: d = o MM Trong đó: d: tỷ trọng
M: khối lượng chất lỏng cần đo cùng thể tích M0: khối lượng nước cất 2 lần
3.5.3.4. Độ nhớt ( )
Sử dụng nhớt kế Oswald hoặc micropipet, xác định độ nhớt ở 200C. Công thức tính: = o o t dd..t Trong đó:
: độ nhớt tương đối so với nước cất 2 lần d0: tỷ trọng nước cất 2 lần
d: tỷ trọng chất lỏng cần đo
t0: thời gian chảy của nước cất qua phần phình hoặc qua mao quản t: thời gian chảy của chất lỏng qua phần phình hoặc qua mao quản. 3.5.3.5. Năng lực đệm ( )
Theo phương pháp của Salisbury (1978), đối với HCl 0,1N, dùng một lọ con khô, sạch, trung tính, có dung tích 5 - 10 ml. Cho vào đó 1 ml (hoặc 0,5 ml) chất lỏng cần kiểm tra, đo pH chất lỏng. Dùng ống hút vi lượng nhỏ dung dịch HCl 0,1N (n = 3,6) vào lọ trên cho đến khi pH = 4,0. Ghi lại độ chênh lệch pH (dpH). Công thức tính: 100 . 1000 . . v dpHn a Trong đó: : Năng lực đệm tính trong 1000 lít chất lỏng a: Lượng axit đã dùng (lượng HCl 0,1N ) n: Đương lượng gam của axit HCl 0,1N dpH: Chênh lệch pH trước và sau sử lý v: Lượng chất lỏng đã dùng
3.5.3.6. Môi trường đông lạnh tinh dịch chó ở -1960C
- Môi trường 1: Tris 3,634 g - Citric acid 1,99 g - fructose 0,5 g - lòng đỏ trứng gà 14 ml - penicillin 100 mg - streptomycin 100 mg - nước cất hai lần đủ 100 ml. Phần A của môi trường không chứa Glycerol, phần B chứa 13% (v/v) Glycerol.
- Môi trường 2: Tris 1,3625 g - fructose 0,375 g - lactose 1,5 g - raffinose 2,7 g - citric acid 0,7615 g - lòng đỏ trứng gà 20 ml - penicillin 100 mg - streptomycin 100 mg - nước cất hai lần đủ 100 ml. Phần A của môi trường không chứa Glycerol, phần B chứa 13% (v/v) Glycerol.
3.5.3.7. Đông lạnh tinh dịch chó ở -1960C Chuẩn bị dụng cụ và hoá chất: a. Dụng cụ:
Các dụng cụ cần thiết gồm: dụng cụ pha môi trường, thu nhận tinh dịch, kiểm tra tinh dịch.
Dụng cụ pha môi trường: các ống đong, bình tam giác có thể tích tương ứng với lượng môi trường cần pha, đũa thuỷ tinh.
Dụng cụ thu nhận tinh dịch: cốc hứng tinh, các lọ thu mẫu bằng thuỷ tinh có thể tích 20 - 30 ml, các pipet pasteur nhựa, pipet thuỷ tinh 5 ml, nhiệt kế có thang đo 1000C.
Dụng cụ kiểm tra tinh dịch: kính hiển vi có độ phóng đại từ 40 đến 1000 lần, lam kính, lamen, bộ đếm hồng cầu, các ống eppendorf 1,5ml.
Các dụng cụ bằng thuỷ tinh được rửa sạch, tráng lại bằng nước cất sau đó bằng cồn, và sấy khô. Các dụng cụ bằng nhựa được rửa sạch, tráng bằng nước cất và bằng cồn sau đó để khô tự nhiên.
b. Hoá chất:
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, citric acid, fructose, Raffinose, penicillin, streptomycin, glycerol, lòng đỏ trứng gà, nước cất hai lần, eosin 5%, dung dịch nước muối sinh lý 0.85%, dung dịch nước muối 3%, cồn sát trùng 70%.
Pha môi trường đông lạnh
Chuẩn bị môi trường đông lạnh: môi trường đông lạnh có các thành phần gồm: Tris 3,634 g - Citric acid 1,99 g - fructose 0,5 g - lòng đỏ trứng gà 14 ml - penicillin 100 mg - streptomycin 100 mg - nước cất hai lần đủ 100 ml. Để pha môi trường, nước cất hai lần được đun cách thuỷ đến sôi. Pha tris, citric acid, fructose với lượng nước vừa đủ, dùng đũa thuỷ tinh đánh tan, để nguội, sau đó bổ sung các kháng sinh, lòng đỏ trứng gà và dùng khuấy từ khuấy đều trong 30 phút. Sau khi pha, môi trường được chia làm 2 phần (môi trường A và môi trường B),
môi trường B được bổ sung glycerol với nồng độ 13 % (v/v) sau đó tiếp tục dùng khuấy từ khuấy đều trong 45 phút (chú ý: không khuấy quá mạnh để không làm chín lòng đỏ trứng). Môi trường sau khi pha được bảo quản ở 40C.
Thu nhận tinh dịch
Cần thiết có tối thiểu 1 người tham gia lấy tinh dịch và 1 người sẵn sàng kiểm tra mẫu. Tinh dịch được thu nhận bằng phương pháp massage, tinh được phóng trực tiếp vào cốc thuỷ tinh đã làm ấm ở 340C. Chỉ thu tinh dịch ở pha thứ hai của quá trình xuất tinh (pha giàu tinh trùng nhất).
Kiểm tra tinh dịch
Ngay sau khi thu nhận, tinh dịch được ghi lại thể tích trên cốc hứng tinh, chuyển tinh dịch vào cốc đựng mẫu, đưa vào nước ấm 340C đã chuẩn bị sẵn. Kiểm tra ngay pH của tinh dịch bằng giấy đo pH (pH của tinh dịch chó ổn định và dao động trong khoảng 6,5 - 7,0. Khi pH tinh dịch nằm ngoài khoảng dao động đó, tinh dịch thường có chất lượng không tốt).
Kiểm tra hoạt lực tinh trùng tiến thẳng: một giọt tinh dịch được lấy ra và nhỏ lên lam kính, đậy lamen và đưa lên kính hiển vi kiểm tra ở độ phóng đại 100 và 400 lần. Hoạt lực được đánh giá theo phần trăm, với thang điểm 100%.
Kiểm tra nồng độ tinh trùng: tinh dịch được pha loãng 200 lần với dung dịch NaCl 3% bằng ống trộn hồng cầu và được đếm ngay, sử dụng buồng đếm Newbouer.
Tỷ lệ tinh trùng sống và tỷ lệ tinh trùng kỳ hình: lấy một giọt tinh dịch được nhuộm bằng thuốc nhuộm eosin, làm tiêu bản quét. Tỷ lệ tinh trùng sống được đếm ngay lập tức trong vòng 1 - 2 phút sau khi nhuộm, đếm tối thiểu 200 tinh trùng có trên tiêu bản. Sau 2 phút, không nên đếm tiếp vì có thể sẽ không còn chính xác. Tiêu bản kỳ hình được làm cùng với tiêu bản sống chết, nhưng được để lại kiểm tra trong thời gian ủ mẫu ở 40C.
Pha loãng tinh dịch với môi trường
Sau khi đã xác định được nồng độ tinh dịch, pha loãng tinh dịch với môi trường A đã được cân bằng nhiệt trong cùng bể nước ấm ủ tinh dịch ở 34oC. Khi pha môi trường nên để môi trường chảy từ từ theo thành cốc đựng mẫu và lắc nhẹ cốc để tinh dịch hoà tan vào môi trường một cách từ từ. Lượng môi trường được tính toán để sao cho trong một cọng rạ có tổng số khoảng 150 triệu tinh trùng. Cốc
chứa tinh đã pha loãng được đặt vào trong một cốc khác có chứa nước được lấy từ chính bể cân bằng tinh dịch và được chuyển vào tủ bảo ôn ở nhiệt độ 40C.
Chú ý: tất cả các thao tác kiểm tra tinh dịch và pha loãng nên được làm trong khoảng từ 5 - 10 phút.
Các bước chuẩn bị và đông lạnh tinh dịch chó Bước 1. In cọng rạ
Đưa cọng rạ vào máy in, các thông số trên cọng rạ gồm: giống, tên (số hiệu), nơi lấy tinh, ngày sản xuất tinh, nơi sản xuất.
Bước 2. Cân bằng tinh dịch và cọng rạ trong tủ bảo ôn ở 40 C trong 2 giờ. Sau đó bổ sung môi trường B và tiếp tục ủ thêm 2 giờ.
Bước 3. Nạp tinh pha loãng vào cọng rạ:
Đưa cọng rạ đã được in số liệu vào máy, sau đó đưa tinh pha loãng của những con có số hiệu tương ứng lên máy lắc từ và để máy đóng cọng tự động. Sau khi nạp tinh, các cọng rạ được xếp lên khay và đưa ngay vào tủ cân bằng ở 40C.
Bước 4. Ủ tinh cọng rạ trong tủ cân bằng nhiệt độ 40 C trong thời gian 3 giờ. Bước 5. Đông lạnh tinh cọng rạ: Nhiệt độ buồng đông lạnh được hạ dần xuống -165oC trong 10 phút.
Bước 6. Thả tinh cọng rạ ở -1650C vào nitơ lỏng -1960C. Tinh cọng rạ được đựng trong các ống. Tinh cọng rạ sau 24 giờ bảo tồn trong nitơ lỏng, một cọng rạ được lấy ra một cách ngẫu nhiên từ mỗi mẫu tinh để giải đông và đánh giá hoạt lực tiến thẳng, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình, tỷ lệ tinh sống của tinh trùng
Bước 7. Giải đông tinh cọng rạ ở nước ấm 370C trong khoảng 30 giây - 60 giây. Bước 8. Kiểm tra chất lượng định kỳ: tinh cọng rạ bảo tồn ở -196 0C được kiểm tra sau 1 tháng, sau 3 tháng và sau 4 tháng .
3.5.3.8. Phương pháp TTNT chó Malinois sử dụng tinh đông lạnh
a. Dụng cụ, hoá chất và vật liệu
- Súng bắn tinh. - Vaseline.
- Cồn khử trùng 70%.
- Nước ấm 370C. - Đồng hồ bấm giờ.
- Nhiệt kế có thang độ 100.
- Các thiết bị khác phục vụ cho giải đông, đánh giá chất lượng tinh dịch và thụ tinh nhân tạo.
b. Tiến hành
- Kiểm tra chất lượng tinh dịch trước khi sử dụng thụ tinh nhân tạo (chỉ sử dụng tinh dịch có hoạt lực tinh trùng sau giải đông ≥ 30%).
- Tinh đông lạnh dạng cọng rạ được giải đông bằng cách nhúng vào nước ấm ở 370C trong 1 phút.
- Lắp cọng rạ vào súng bắn tinh đã được khử trùng bằng cồn 70% và được bôi trơn bằng vaseline.
Thao tác thụ tinh nhân tạo
Giữ chó cái ở tư thế đứng, toàn bộ thân tạo thành một đường thẳng, điều này giúp cho việc đưa súng bắn tinh vào tử cung một cách dễ dàng.
Tay thuận cầm súng bắn tinh, tay còn lại kích thích nhẹ vào âm đạo của chó cái.
Tay thuận đưa súng bắn tinh vào âm đạo. Hướng súng bắn tinh chết từ dưới lên trên với góc 45 độ, sau khi đưa được súng bắn tinh vào âm đạo, súng bắn tinh có hướng song song với lưng của chó cái, tay kia vẫn kích thích nhẹ nhàng vào âm đạo.
Súng bắn tinh được đưa vào khoảng 15-30 cm thì gặp cổ tử cung (cảm giác khựng lại do gặp cổ tử cung). Thao tác nhẹ nhàng đưa đầu súng bắn tinh qua cổ tử cung. Tiếp theo đó tay kia cố định súng bắn tinh ở điểm gần âm đạo, tay thuận nhẹ nhành đẩy tinh dịch trong cọng rạ vào trong tử cung của chó cái. Sau đó nhẹ nhàng đưa súng bắn tinh ra khỏi âm đạo, vỗ nhẹ vào hông để tạo phản xạ đóng cổ tử cung, tránh tinh dịch chảy ra ngoài.
Theo dõi chó cái đã phối giống. Sau một tháng phối giống, khám thai cho chó.
Sơ đồ 3.1. Quy trình thụ tinh nhân tạo cho chó sử dụng tinh đông lạnh dạng cọng rạ
3.5.4. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý theo chương trình phần mềm Excel 2007 và minitab 16.0.
A ≥ 30%
Chuẩn bị dụng cụ thụ tinh nhân tạo Giải đông tinh cọng rạ bằng
nước ấm 370C trong 1 phút
Khử trùng và bôi vaseline cho súng bắn tinh Lắp tinh cọng rạ vào
súngbắn tinh
Dẫn tinh cho chó cái
thụ tinh nhân tạo Theo dõi chó cái sau phối giống
QUY TRÌNH THỤ TINH NHÂN TẠO CHÓ SỬ DỤNG TINH ĐÔNG LẠNH
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀO THẢO LUẬN 4.1. SINH HỌC TINH DỊCH CHÓ MALINOIS 4.1. SINH HỌC TINH DỊCH CHÓ MALINOIS
4.1.1. Một số đặc điểm sinh học tinh dịch chó Malinois