4.2.7. Ảnh hưởng của tốc độ giải đông lên phẩm chất tinh đông lạnh
Bảng 4.9. Ảnh hưởng của tốc độ giải đông (nhiệt độ và thời gian) lên chất lượng tinh đông lạnh – giải đông (n=40)
Nhiệt độ giải đông (0C) Thời gian giải đông (giây) Hoạt lực tinh trùng sau giải đông (%) Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình sau giải đông (%) Tỷ lệ tinh trùng sống sau giải đông (%) 37 15 39,50 2,35 24,36 2,67 62,29a 3,35 37 30 39,38 3,57 26,58 2,49 72,41b 2,85 37 60 39,80 2,69 26,42 2,58 71,48 b 3,47 70 8 40,65 3,35 27,37 3,34 73,59 b 2,56
Tinh đông lạnh cọng rạ được giải đông theo hai phương pháp (giải đông chậm và giải đông nhanh). Giải đông chậm: nhúng tinh cọng rạ vào nước ấm 370C trong khoảng thời gian 15 giây, 30 giây, 60 giây. Giải đông nhanh: nhúng tinh đông lạnh vào nước nóng 700C trong khoảng thời gian 8 giây. Kết quả ảnh hưởng của phương pháp giải đông và tốc độ giải đông lên phẩm chất tinh trùng sau đông lạnh giải đông được thể hiện ở bảng 9. Kết quả cho thấy: phương pháp giải đông tinh đông lạnh ảnh hưởng không có ý nghĩa lên hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh. Tuy nhiên, trong thực tế nên chọn phương pháp giải đông chậm, vì phương pháp này có độ an toàn cao hơn phương pháp giải đông nhanh. Các phương pháp giải đông tinh đông lạnh ảnh hưởng không có ý nghĩa lên tỷ lệ tinh trùng kỳ hình và hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh.
Tốc độ giải đông tinh đông lạnh có ảnh hưởng lên tỷ lệ tinh trùng sống sau đông lạnh - giải đông. Giải đông tinh đông lạnh ở nhiệt độ 370C, trong các khoảng thời gian 30 giây hoặc 60 giây và giải đông ở nhiệt độ 70oC trong thời gian 8 giây cho tỷ lệ tinh trùng sống cao hơn có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với giải đông ở nhiệt độ 37oC trong thời gian 15 giây.
Qua phân tích kết quả cho thấy giải đông tinh đông lạnh ở nhiệt độ 370C với thời gian là 30 giây, 60 giây cho kết quả tốt về phẩm chất tinh trùng sau giải đông và dễ áp dụng trong thực tiễn thụ tinh nhân tạo cho chó.
Tóm lại, nghiên cứu đã cho thấy, bổ sung Glycerol nồng độ 6,5% hoặc 7% sau 2 giờ ủ có khả năng duy trì sức sống của tinh trùng tốt nhất. Thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh tối thiểu là 4 giờ. Giải đông tinh cọng dạ ở 370C trong 30 giây hoặc 60 giây cho kết quả phẩm chất tinh dịch tốt.
Dựa trên các kết quả nghiên cứu có được, chúng tôi đã xây dựng quy trình công nghệ đông lạnh tinh dịch Malinois nhằm bảo tồn tinh dịch, phục vụ công tác bảo tồn nguồn gen và thụ tinh nhân tạo.
Sơ đồ 4.1. Quy trình đông lạnh tinh dịch chó Malinois 4.2.8. Kết quả sản xuất đông lạnh tinh dịch của chó
4.2.8.1. Hoạt lực tinh trùng trong quá trình đông lạnh
Dựa trên phẩm chất tinh dịch của 7 chó Malinois nghiên cứu, chúng tôi lựa chọn 4 cá thể chó Malinois chó phẩm chất tinh dịch tốt nhất để sản xuất tinh đông lạnh cọng rạ.
Sau khi ổn định quy trình đông lạnh tinh dịch chó, đã thử nghiệm sản xuất được 219 liều tinh đông lạnh của 4 chó Malinois (chó Ken 60 liều, chó Zon 54 liều, chó Fido 50 liều, chó Miki 55 liều ). Hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau giải đông đạt trung bình 40,45% (chó Ken: 40,52%, chó Zon: 38,29%, chó Fido: 41,36%, chó Miki: 40,58%).
Bảng 4.10. Hoạt lực tinh trùng trong quá trình đông lạnh (n=30)
Chỉ tiêu Ken Zon Fido Miki TB
Hoạt lực tinh trùng của
tinh nguyên (%) 74,58 ± 3,47 73,59 ± 2,52 74,36 ± 2,72 73,69± 2,34 74,05 ± 2,27
Hoạt lực tinh trùng trước
đông lạnh (%) 70,36 ± 2,43 69,48 ± 3,27 68,96 ± 2,45 68,53±2,86 69,47 ± 3,42
Hoạt lực tinh trùng sau
đông lạnh (%) 40,52 ± 4,46 38,29 ± 2,17 41,36 ± 3,67 40,58 ± 2,53 40,45 ± 3,74
Số cọng có hoạt lực tinh
trùng sau đông lạnh ≥30%. 60 54 50 55 219
Hoạt lực tinh trùng giảm dần trong quá trình ủ tinh dịch trước đông lạnh. Trong quá trình đông lạnh tinh dịch, sự giảm nhiệt độ đã gây hiện tượng sốc nhiệt đối với tinh trùng là nguyên nhân làm giảm hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh so với trước đông lạnh. Tuy nhiên hoạt lực của tinh trùng sau đông lạnh giải đông đạt tiêu chuẩn bảo tồn phục vụ cho thụ tinh nhân tạo và bảo tồn nguồn gen chó Malinois.
So sánh với kết quả nghiên cứu của Đỗ Văn Thu (2010), hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh của chó Malinois(40,45%) tương đương với kết quả trên chó Berger (40,84%) và Labrador(41,62%) nhưng cao hơn trên chó Cocker (38,75%). 4.2.8.2. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình trong quá trình đông lạnh
Tinh nguyên sử dụng để đông lạnh có tỷ lệ tinh trùng kỳ hình trung bình là: 18,39%. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình tăng dần trong khoảng ủ tinh dịch ở 40C trước đông lạnh (21,48%), như vậy với nhiệt độ 40C đã có ảnh hưởng đến cấu trúc hình thái của tinh trùng. Đông lạnh tinh dịch ở nhiệt độ âm là nguyên nhân chính làm tăng tỷ lệ tinh trùng kỳ hình sau giải đông (25,23%). Kết quả này tương đồng với kết quả của Đỗ Văn Thu (2010) khi sản xuất tinh đông lạnh chó Berger và Labrador (25,31%). Trong thành phần của môi trường đông lạnh tinh dịch có chất bảo vệ lạnh glycerol có tác dụng bảo vệ cấu trúc của tế bào tinh
trùng, tránh được hiện tượng kết tinh của nước trong quá trình đông lạnh, vì vậy tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng sau đông lạnh tuy tăng nhưng vẫn nằm trong giới hạn cho phép để bảo tồn.
Bảng 4.11. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình trong quá trình đông lạnh (n=30)
Chỉ tiêu đánh giá Ken Zon Fido Miki TB
Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình
của tinh nguyên (%) 18,25 ± 2,74 17,53 ± 2,41 18,62 ± 2,43 18,15 ± 2,26 18,39 ± 2,74
Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của tinh pha loãng trước đông lạnh (%)
20,63 ± 3,38 21,28 ± 2,58 22,42 ± 2,46 21,56 ± 2,52 21,48 ± 3,67 Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình
của tinh sau đông lạnh - giải đông (%)
25,49 ± 3,19 23,76 ± 4,37 26,53 ± 4,59 25,87± 3,46 25,23 ± 4,38 4.2.8.3. Tỷ lệ sống của tinh trùng trong quá trình đông lạnh
Sự vận động của tinh trùng trong thời gian ủ tinh dịch đã làm tiêu hao năng lượng dự trữ của tinh trùng, đặc biệt sự hạ nhiệt độ xuống dưới âm độ là nguyên nhân giảm tỷ lệ sống của tinh trùng trong quá trình đông lạnh tinh dịch. Tỷ lệ sống của tinh trùng ngay sau khai thác tinh đạt giá trị trung bình 87,69%. Tỷ lệ sống của tinh trùng giảm trong thời gian ủ trước đông lạnh và đạt giá trị trung bình 82,12%. Sự giảm nhiệt độ trong quá trình đông lạnh tinh dịch và sự tăng nhiệt độ trong quá trình giải đông tinh đông lạnh là những yếu tố chủ yếu ảnh hưởng đến giảm tỷ lệ sống của tinh trùng sau đông lạnh - giải đông. Tỷ lệ sống của tinh trùng sau đông lạnh - giải đông đạt giá trị trung bình 69,34%. Kết quả này thấp hơn không đáng kể so với kết quả sản xuất tinh đông lạnh trên chó Berger của Đỗ Văn Thu (2010) là 70,52%. Với kết quả nhận được, cho thấy quy trình đông lạnh tinh dịch chó Malinois mà chúng tôi đã nghiên cứu có tính ổn định và đã sản xuất được 219 liều tinh cọng rạ có chất lượng tốt đảm bảo cho thụ
Bảng 4.12. Tỷ lệ sống của tinh trùng trong quá trình đông lạnh (n=30)
Chỉ tiêu Ken Zon Fido Miki TB
Tỷ lệ tinh trùng sống
của tinh nguyên (%) 87,43 ± 2,18 88,75 ± 3,35 86,38 ± 3,42 87,19 ± 2,58 87,69 ± 3,35 Tỷ lệ tinh trùng sống
của tinh dịch pha loãng trước đông lạnh (%)
81,29 ± 3,34 84,21 ± 2,26 80,41 ± 2,57 81,13 ± 3,17 82,12 ± 2,67 Tỷ lệ tinh trùng sống
của tinh sau đông
lạnh - giải đông (%) 70,46 ± 5,46 68,24 ± 4,15 69,54 ± 5,36 68,96 ± 3,65 69,34 ± 4,52 4.2.9. Kết quả kiểm tra định kỳ chất lượng tinh chó Malinois đông lạnh 4.2.9.1. Hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng chó Malinois đông lạnh trong thời gian bảo tồn ở -1960C
Tinh dịch chó Malinois sau khi đông lạnh được giải đông để đánh giá hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau giải đông và trong thời gian bảo tồn ở -1960C. Chúng tôi giải đông tinh ở các thời điểm: ngay sau khi đông lạnh, sau 01 tháng, sau 03 tháng và sau 04 tháng. Kết quả đánh giá hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau giải đông của tinh đông lạnh chó Malinois được thể hiện ở bảng 4.13.
Bảng 4.13. Hoạt lực tinh trùng của tinh đông lạnh trong thời gian bảo tồn ở -1960C (n=16)
Mẫu tinh đông lạnh
Hoạt lực tinh trùng tương ứng với thời gian bảo tồn
Sau đông lạnh Sau 01 tháng Sau 03 tháng Sau 04 tháng
Ken 40,85% 40,50% 40,00% 40,00%
Zon 38,75% 38,00% 38,00% 38,00%
Fido 41,62% 40,25% 40,00% 40,00%
Miki 40,50% 40,00% 40,00% 40,00%
Hoạt lực tinh trùng tiến thẳng sau giải đông giảm không có ý nghĩa trong thời gian bảo tồn. Ở cả 4 chó Malinois, hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau giải đông tương đối ổn định ở tất cả các thời điểm giải đông: sau đông lạnh, sau 1 tháng, sau 3 tháng, sau 4 tháng bảo tồn. Cụ thể hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh của 4 chó Ken, Zon, Fido, Miki lần lượt là 40.85%; 38,75%; 41,62% và 40,05%. Hoạt lực tinh trùng của 4 chó trên ở thời điểm sau 3 tháng bảo tồn là 40,00%, 38,00%, 40,00%, 40,00% và ở thời điểm sau 4 tháng bảo tồn là 40,00%, 38,00%, 40,00%, 40,00%.
Với kết quả kiểm tra hoạt lực của tinh trùng sau giải đông cho thấy tinh đông lạnh có chất lượng ổn định trong quá trình bảo tồn ở -1960C.
4.2.9.2. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của tinh đông lạnh trong thời gian bảo tồn ở - 1960C
Chúng tôi tiến hành giải đông tinh cọng rạ đông lạnh tại các thời điểm: ngay sau khi đông lạnh, sau 01 tháng, sau 03 tháng và sau 04 tháng, kết quả được trình bày ở bảng 4.14.
Bảng 4.14. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của tinh đông lạnh trong thời gian bảo tồn ở -1960C (n=16)
Mẫu tinh đông lạnh
Tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng sau đông lạnh - giải đông tương ứng với thời gian bảo tồn
Sau đông lạnh Sau 01 tháng Sau 03 tháng Sau 04 tháng
Ken 24,27% 24,35% 24,59% 24,55%
Zon 25,39% 25,62% 25,77% 25,80%
Fido 23,41% 23,78% 23,98% 23,98%
Miki 24,36% 24,51% 24,85% 24,90%
Trung bình 24,36% 24,56% 24,80% 24.80%
Số liệu thu được cho thấy, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình trong cùng một giống chó ở các thời điểm giải đông khác nhau không có ý nghĩa thống kê (P>0,05). Cụ thể, đối với chó Ken, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình trung bình được giải đông ngay sau khi đông lạnh là 24,27%. Sau 03 tháng bảo tồn, tỷ lệ này là 24,59%, và sau 4 tháng là 24,55%. Tương tự đối với 3 chó còn lại, sự khác nhau về tỷ lệ tinh trùng kỳ hình sau đông lạnh – giải đông khác nhau không có nghĩa thống kê. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình sau đông lạnh – giải đông giữa các chó thí nghiệm khác nhau
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, chất lượng của tinh trùng bị ảnh hưởng lớn bởi các yếu tố thời gian khai thác, chất lượng con giống và môi trường bảo quản. Môi trường bảo quản có vai trò quan trọng trong việc duy trì chất lượng của tinh dịch trong thời gian bảo tồn, đảm bảo khả năng thụ tinh của tinh trùng sau khi giải đông. Ở nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành giải đông tinh đông lạnh ở nhiều thời điểm khác nhau, kết quả cho thấy tỷ lệ tinh trùng kỳ hình khác nhau không có ý nghĩa ở tinh dịch được giải đông ở thời điểm ngay sau đông lạnh và sau 04 tháng bảo quản. Điều này bước đầu cho phép chúng tôi kết luận, môi trường bảo quản đang sử dụng là phù hợp cho việc đông lạnh và bảo quản tinh dịch chó Malinois trong nitơ lỏng ở -1960C.
4.3. KẾT QUẢ THỤ TINH NHÂN TẠO CHO CHÓ MALINOIS
Chúng tôi tiến hành sử dụng tinh đông lạnh dạng cọng rạ của 4 chó Ken, Zon, Fido, Miki bảo tồn trong nitơ lỏng ở -1960C để thụ tinh nhân tạo cho 10 chó cái giống tại Cục Cảnh sát quản lý, huấn luyện và sử dụng động vật nghiệp vụ (K204) - Bộ Công an. Tỉ lệ mang thai đạt 60%, số con sinh ra là 44 trong đó tỉ lệ đực/cái là 22/20. Số chó con trung bình là 7 con/lứa. Khối lượng sơ sinh của chó con đạt trung bình 352g/con, tương đương với khối lượng sơ sinh của chó con sinh ra do phối giống tự nhiên (350g/kg).
Có 4 chó không mang thai, tuy nhiên, việc chó không mang thai có rất nhiều nguyên nhân gây ra. Trong khuôn khổ của đề tài, chúng tôi không có đủ điều kiện và thời gian để đánh giá chính xác về nguyên nhân không mang thai ở 4 chó cái này.
Các tinh cọng rạ sử dụng cho thụ tinh có chất lượng đồng đều, hoạt lực tinh trùng sau giải đông đạt 38 - 40%. Sử dụng các cọng rạ có thể tích 0,25 ml, phối 2 cọng rạ/một lần (tương đương 50 x106 tinh trùng)và phối 2 lần. Khoảng cách thời gian giữa 2 lần phối là 48 giờ.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng hầu hết là các tinh cọng rạ có thời gian bảo tồn từ 20 ngày đến 70 ngày. Kết quả cho thấy tinh trùng chó Malinois được bảo quản dạng đông lạnh trong nitơ lỏng vẫn có chất lượng cao và ổn định theo thời gian. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa lớn, thành công trong nghiên cứu công nghệ đông lạnh tinh chó Malinois sẽ giúp cho việc bảo tồn nguồn gen quí của những con chó có chất lượng tốt.
Bảng 4.15. Kết quả thụ tinh nhân tạo bằng tinh chó Malinois đông lạnh Tên Tên đực giống Hoạt lực tinh trùng sau giải đông Liều phối (Cọng rạ 0,25 ml) Chó cái
giống giống lần 1 Ngày phối giống lần 2 Ngày phối Ngày đẻ
Số con Khối lượng sơ
sinh trung bình (g) Đực (22) Cái (20) Ken 40 02 Igor 05.01. 2016 07.01. 2016 09.03.2016 3 4 320 Ken 40 02 Daisy 08.01. 2016 10.01. 2016 11.03.2016 4 2 375
Zon 40 02 Monika 15.01. 2016 17.01. 2016 Không chửa
Zon 40 02 Lady 27.01.2016 29.01.2016 28.03.2016 5 2 336
Fido 38 02 Melisa 28.01.2016 30.01.2016 Không chửa
Ken 38 02 Elsa 08.02.2016 10.02.2016 10.04.2016 3 4 381
Miki 39 02 Benzi 11.02. 2016 13.02. 2016 15.04.2016 4 4 306
Miki 40 02 Mony 12.02. 2016 14.02. 2016 Không chửa
Fido 40 02 Lusa 16.02.2016 18.02.2016 17.04.2016 3 4 394
Fido 40 02 Sera 25.02.2016 27.02.2016 Không chửa
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN 5.1. KẾT LUẬN
- Đánh giá được một số chỉ tiêu sinh học và tính chất lý - hóa học của tinh dịch chó Malinois. Lượng tinh dịch chó 1,94 ml, hoạt lực tinh trùng tiến thẳng 72,86%, nồng độ tinh trùng 245,53 triệu/ml, tỷ lệ tinh trùng sống 82,70%, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình 18,85%, pH 6,71, Áp lực thẩm thấu 344,12 miliosmol/kg, năng lực đệm 1314,19, tỷ trọng 1,03, độ nhớt 3,12.
- Xây dựng thành công môi trường đông lạnh tinh dịch chó Malinois. Đồng thời nghiên cứu được ảnh hưởng của một số yếu tố ảnh hưởng đến phẩm chất tinh dịch chó Malinois sau đông lạnh – giải đông: bổ sung chất bảo vệ lạnh glyceron 6,5 - 7% vào môi trường đông lạnh, thời gian ủ tinh dịch trong khoảng 6 - 8 giờ.
- Đã sản xuất và bảo tồn được 219 liều tinh chó Malinois đông lạnh cọng rạ (hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh 38 - 40%). Tinh chó đông lạnh có chất lượng ổn định trong thời gian bảo tồn ở nitơ lỏng -1960C.
- Thụ tinh nhân tạo cho chó Malinois sử dụng tinh đông lạnh bảo tồn ở - 1960C. Tỷ lệ thụ thai đạt 60%, số chó con sinh ra là 42 con , số con trung bình là 7 con/ổ, tỷ lệ đực cái 22/20, khối lượng sơ sinh của chó con 352g/con.