Trong nghiên cứu này, chúng tôi tách, tinh sạch ADN tổng số theo các bước như sau:
(1) Ly giải mẫu ;
- 250 µl huyễn dịch mẫu bệnh phẩm được trộn đều trong 500 µl dung dịch sucrose/proteinase K ;
- Ủ ở 56oC/90 phút hoặc 37oC/12giờ.
(2) Tách pha ADN bằng phenol-chloroform-isoamyl (25:24:1) - Bổ sung 200 µl dung dịch PCI vào ống mẫu sau khi ly giải; - Vortex hỗn hợp;
(3) Tủa ADN
- Dùng ống Eppendorf mới, trộn 450μl isopropyl + 450μl dịch nổi phía trên, trộn đều;
- Tủa ADN ở -20oC/15 phút;
- Ly tâm, 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4oC. (4) Rửa tủa ADN
- Rửa mẫu bằng 1ml cồn 70% (pha trong nước cất đã xử lý DEPC); - Ly tâm, 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4oC;
- Loại bỏ hết cồn. Hong khô ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. (5) Hòa tan tủa ADN
- Tủa ADN được hòa tan trong 30µl dung dịch đệm TE (pH = 8,0). 3.5.3. Phương pháp tối ưu phản ứng PCR phát hiện FAdV
Cặp mồi đặc hiệu dùng phát hiện FAdV được lựa chọn theo nghiên cứu đã công bố (Ganesh et al., 2002), với trình tự được trình bày ở bảng 3.1. Do thành phần của phản ứng PCR dùng trong nghiên cứu này và nghiên cứu trước đây có sự thay đổi, nên việc tối ưu lại phản ứng PCR là cần thiết.
Bảng 3.1. Trình tự mồi đặc hiệu phát hiện và giải trình tự gen hexon của FAdV
Mồi xuôi/ ngược Trình tự 5’ – 3’ Kích thước (bp)
FAVHL/ GACATGGGGTCGACCTATTTCGACAT
731
/FAVHR AGTGATGACGGGACATCAT
3.5.3.1. Tối ưu hóa nhiệt độ bắt mồi
Nhiệt độ bắt mồi được thiết lập biến thiên từ 45,0oC đến 65,5oC sử dụng máy gradient PCR. Các điều kiện khác của phản ứng PCR như: nồng độ mồi, nồng độ sợi khuôn được đảm bảo đồng đều giữa các phản ứng PCR. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Giai đoạn phản ứng Nhiệt độ Thời gian (giây) Số vòng lặp Tiền biến tính 94 180 1 Biến tính 94 15 40 Bắt mồi Gradient* 20 Kéo dài 72 60
Kéo dài cuối cùng 72 300 1
Ghi chú: Gradient bao gồm 12 nhiệt độ gắn mồi khác nhau: 45,0; 45,3; 46,4; 48,2; 50, 4; 53,0; 55,8; 58,5; 61,0; 63,1; 64,7; 65,5.
Phân tích sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trong thạch agarose 2%, có bổ sung RedSafeNucleic Acid Staining Solution 1x. Nhiệt độ gắn mồi ở đó không có vạch sản phẩm không đặc hiệu và vạch sản phẩm đặc hiệu sáng rõ nhất được lựa chọn là nhiệt độ bắt mồi tối ưu.
3.5.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ mồi
Nồng độ cuối cùng (final concentration) của mồi trong phản ứng PCR thường biến thiên trong khoảng 0,05-1 µM. Trong nghiên cứu này, nồng độ mồi cuối cùng được thiết lập biến thiên trong khoảng 0,5 µM đến 0,125 µM. Sự phối trộn giữa mồi xuôi- mồi ngược của phản ứng PCR được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ mồi Mồi xuôi (nồng độ cuối cùng, µM)
Mồi ngược (nồng độ cuối cùng, µM) 0,500 0,250 0,125 0,500 0,250 0,125
Mỗi nồng độ mồi xuôi sẽ lần lượt được kết hợp với 3 nồng độ của mồi ngược, theo sơ đồ trình bày ở bảng 3.3. Phản ứng PCR được thực hiện ở nhiệt độ tối ưu (xác định ở mục tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi, đồng thời đảm bảo thêm điều kiện đồng đều về thể tích phản ứng, nồng độ sợi khuôn. Sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trong thạch agarose 2%, có bổ sung
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution 1x. Nồng độ mồi ở đó cho vạch sản phẩm đặc hiệu sáng rõ nhất sẽ được lựa chọn để thực hiện các phản ứng PCR xác định FAdV.
3.5.4. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử
Mối quan hệ di truyền của FAdV (phylogenetic tree) được xây dựng dựa trên một phần trình tự gen mã hóa protein hexon (608 nucleotide). Phần mềm MEGA6 (Tamura et al., 2013) được dùng để xây dựng cây phát sinh chủng loại với các tham số đầu vào như sau: (i) phương pháp suy diễn cây phát sinh chủng loại là Neighbor-Joining; (ii) mô phỏng sự thay đổi nucleotide giữa các trình tự gen dựa vào mô hình Tajima-Nei và có hiệu chỉnh sự biến động giữa các nucleotide; (iii) mức tin cậy ở các nhánh của cây phát sinh chủng loại được ước tính bằng phép thử bootstrap lặp lại 1000 lần. Các trình tự tham chiếu (để xác định nhóm di truyền) dựa theo công bố trước đây (McFerran and Smyth, 2000; Meulemans et al., 2004).
3.5.5. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của FAdV serotype 4 serotype 4
Nhằm tìm hiểu đặc điểm dịch tễ học phân tử của FAdV serotype 4 (FAdV4) phát hiện được trong nghiên cứu này và trả lời câu hỏi: (1) nguồn gốc phát sinh từ đâu và (2) lưu hành ở Việt Nam từ khi nào, chúng tôi tiến hành phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử theo không gian (quốc gia). Cơ sở dữ liệu dùng cho phân tích là một phần trình tự gen mã hóa protein hexon các chủng FAdV4 (có trong ngân hàng gen, Genbank) tương đồng ít nhất 99% về trình tự nucleotide với chủng FAdV4- F5. Các bước thực hiện được tóm tắt như sau:
(1) Dùng công cụ BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) để tìm kiếm trình tự gen tương đồng 99% với đoạn gen so sánh,
(2) Sàng lọc và giữ lại các trình tự có đầy đủ thông tin về địa điểm phân lập (quốc gia) và năm phân lập,
(3) Dùng phần mềm BEAST (Drummond et al., 2012) để xây dựng lại quá trình phát tán của các chủng virus FAdV4 theo không gian và thời gian, với các tham số dựa theo kết quả nghiên cứu trước đây (Lemey et al., 2009).
Bảng 3.4. Trình tự hexon gen dùng trong nghiên cứu này
TT Mã số Giống Serotype Nhóm TT Mã số Giống Serotype Nhóm
1 AF339914 A EU/US1 A 22 AF339923 C US9 C
2 AF508952 B EU5 B 23 AF508946 D EU2 D2
3 AY581295 C EU/US4 C 24 AF508949 D EU3 D3
4 EF685395 C EU/US4 C 25 AF339925 D US12 D2
5 EU847626 C EU/US4 C 26 AF339921 D US6 D3
6 FN869969 C EU/US4 C 27 AF339918 D US8 D3
7 FN869970 C EU/US4 C 28 AF508954 E EU6 D1
8 FN869971 C EU/US4 C 29 AF339922 E EU7 D1
9 FN869972 C EU/US4 C 30 AF508955 E EU7 D1
10 FN869973 C EU/US4 C 31 AF508956 E EU8 D1
11 FN869975 C EU/US4 C 32 AF508958 E EU9 D1
12 FN869976 C EU/US4 C 33 AF339924 E US10 D1
13 FN869977 C EU/US4 C 34 AF339920 E US11 D1
14 FN869978 C EU/US4 C 35 AF339919 E US5 D1
15 HM592274 C EU/US4 C 36 F11 16 HM592277 C EU/US4 C 37 F3 17 HM592281 C EU/US4 C 38 F5 18 HM592284 C EU/US4 C 39 F6 19 HQ697593 C EU/US4 C 40 F7 20 AF508959 C EU11 D2 41 F8 21 AF508951 C EU4 C 42 F9
Ghi chú: sự phân chia thành “giống” và “serotype” được dựa vào nghiên cứu trước đây (McFerran and Smyth; 2000, Meulemans et al., 2004). Phân loại serotype theo danh pháp của châu Âu (EU), theo danh pháp của Mỹ
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH SỰ LƯU HÀNH FAdV Ở ĐÀN GÀ NUÔI TẠI HÀ NỘI VÀ VÙNG PHỤ CẬN HÀ NỘI VÀ VÙNG PHỤ CẬN
4.1.1. Kết quả tối ưu hóa phản ứng PCR
Nghiên cứu này đã tìm điều kiện phù hợp nhất của phản ứng PCR phát hiện FAdV bằng cách tối ưu nhiệt độ bắt mồi (hình 4.1) và nồng độ mồi phù hợp (hình 4.2).
Hình 4.1. Tối ưu hóa nhiệt độ bắt mồi của phản ứng PCR
Nhiệt độ bắt mồi được thiết lập biến thiên từ 45,0oC đến 65,6oC. M: 100 bp DNA ladder. Ký hiệu vạch số 1, 3 và 4 là các sản phẩm PCR không đặc hiệu; vạch số 2 là sản phẩm PCR đặc hiệu.
Ở dải nhiệt độ từ 45,0oC đến 46,4oC luôn quan sát được bốn vạch sản phẩm PCR (ký hiệu số 1 - 4, hình 4.1). Trong đó vạch số 2 có kích thước khoảng 731bp là vạch đặc hiệu, các vạch số 1, 3 và 4 có kích thước khoảng 1100bp, 500bp và 300bp là vạch không đặc hiệu (có kích thước không đúng với thiết kế). Ở dải nhiệt độ bắt mồi từ 48,2oC đến 53,0oC số vạch không đặc hiệu giảm xuống (chỉ còn vạch số 1). Chỉ ở nhiệt độ bắt mồi ≥ 55,8oC các vạch không đặc hiệu mới không xuất hiện (hình 4.1).
Về đậm độ của sản phẩm PCR đặc hiệu (vạch số 2), dễ dàng nhận thấy sự tăng dần về độ dày của vạch sản phẩm PCR từ khoảng 45,0oC đến 58,5oC; từ nhiệt độ bắt mồi ≥ 61oC, độ dày vạch sản phẩm PCR giảm xuống rõ rệt. Với hai nhận xét kể trên, chúng tôi chọn nhiệt độ bắt mồi phù hợp là 58,5oC để thực hiện phản ứng PCR. Qua đó cũng thấy rằng việc tối ưu nhiệt độ bắt mồi là vô cùng cần thiết để cho sản phẩm PCR đặc hiệu, với hiệu suất cao nhất. Phản ứng PCR tiếp tục được tối ưu bằng việc điều chỉnh nồng độ mồi xuôi và nồng độ mồi ngược (hình 4.2).
Hình 4.2. Kết quả tối ưu nồng độ mồi của phản ứng PCR
Nồng độ mồi và sự kết hợp nồng độ mồi xuôi và mồi ngược được trình bày ở bảng đi kèm. M là thang ADN chuẩn với khoảng cách giữa các vạch của thang là 100bp.
Dễ dàng nhận thấy chỉ có 5/9 giếng (từ số 1 đến 5) cho vạch sản phẩm đặc hiệu. Các công thức kết hợp mồi khác đều không cho vạch sản phẩm PCR. So sánh đậm độ của các vạch sản phẩm PCR, có thể thấy ở nồng độ mồi xuôi và mồi ngược là 0,5 µM mỗi loại sẽ có mức dương tính mạnh nhất. Từ hình 4.1 và 4.2, chúng tôi rút ra điều kiện tối ưu của phản ứng PCR phát hiện FAdV bằng cặp mồi FAVHL/ FAVHR là: (i) nhiệt độ bắt mồi 58,5oC; (ii) nồng độ mồi cuối cùng là 0,5 µM cho mỗi loại.
4.1.2. Tổng hợp tình hình thu thập mẫu phục vụ nghiên cứu
Trên thế giới đã có những công bố về sự lưu hành và gây bệnh của các chủng FAdV ở đàn gà nhưng tại Việt Nam cho đến thời điểm này vẫn chưa có công bố nào về sự lưu hành của virus này. Do FAdV thường gây bệnh thể cận lâm sàng, nhiễm ghép với nhiều mầm bệnh, đặc biệt nguy hiểm có khả năng gây ức chế miễn dịch ở gà, vì đây là nghiên cứu đầu tiên để xác định sự có mặt của virus FAdV ở đàn gà nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận nên chúng tôi đặt vấn đề lấy mẫu ở gà tất cả các lứa tuổi, các giống gà khi có biểu hiện triệu chứng lâm sàng ủ rũ, mệt mỏi, khó thở, ỉa chảy…. Tổng hợp tình hình thu thập mẫu trong nghiên cứu này được trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Tổng hợp tình hình thu thập mẫu gà theo lứa tuổi Tuần tuổi Tổng hợp < 3 3 ÷ 5 ≥ 6 Số trại 1 6 7 14 Số mẫu 8 72 44 124
Trong suốt quá trình thực hiện đề tài đã thu thập được mẫu từ 14 trại để kiểm tra sự lưu hành FAdV với tổng số mẫu thu được là 124. Mẫu được chia thành 3 nhóm lứa tuổi gồm gà nhỏ hơn 3 tuần tuổi; gà từ 3 tuần đến dưới 6 tuần tuổi và gà từ 6 tuần tuổi trở lên. Cơ sở của việc phân loại lứa tuổi trên là dựa vào đặc điểm dịch tễ của bệnh theo tài liệu tham khảo của các nghiên cứu trên thế giới.
4.1.3. Kết quả PCR phát hiện FAdV trong mẫu bệnh phẩm
Thực hiện phản ứng PCR để xác định sự có mặt của FAdV trong các mẫu bệnh phẩm thu thập được chúng tôi có kết quả minh họa ở hình 4.3 và tổng hợp ở bảng 4.2.
Hình 4.3. Minh họa kết quả phản ứng PCR phát hiện FAdV
M là thang ADN chuẩn với khoảng cách giữa các vạch là 100bp. Giếng ký hiệu từ 1-6 là 6 mẫu bệnh phẩm thu thập ở trang trại 1.
Ứng dụng điều kiện tối ưu của phản ứng PCR với mẫu thực địa, chúng tôi thấy ở những mẫu âm tính (số 1, 4 và 6) không xuất hiện vạch sản phẩm. Mẫu số 2 và 5 có vạch sạch phẩm tương ứng với đối chứng dương, không thấy xuất hiện bất kỳ vạch không đặc hiệu nào. Như vậy điều kiện của phản ứng PCR và cặp mồi hiện thời hoạt động tốt. Tổng hợp kết quả chẩn đoán được trình bày ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Kết quả PCR phát hiện FAdV theo trại được kiểm tra TT trại Số mẫu kiểm tra Số (+) Tỷ lệ (+) (%) Số (-) Tỷ lệ (-) (%) 1 14 5 35,71 9 64,29 2 9 3 33,33 6 66,67 3 8 0 0 8 100 4 10 4 40.00 6 60,00 5 7 2 28,57 5 71,43 6 6 2 33,33 4 66,67 7 16 5 31,25 11 68,75 8 8 2 25,00 6 75,00 9 8 3 37,50 5 62,50 10 10 0 0 10 100 11 7 0 0 7 100 12 6 0 0 6 100 13 8 0 0 8 100 14 7 0 0 7 100 Tổng hợp 124 26 20,97 98 79,03 (+) dương tính; (-): âm tính
Như vậy trong số 14 trại kiểm tra có đến 8 trại (tỷ lệ 57,14%) phát hiện có sự lưu hành của FAdV. Trong tổng số 124 mẫu bệnh phẩm của gà có triệu chứng lâm sàng được kiểm tra thì tỷ lệ phát hiện được FAdV là 26 mẫu (tỷ lệ 20,97%).Kết quả trên cho thấy trong các đàn gà nuôi tại khu vực Hà Nội và vùng phụ cận có sự lưu hành FAdV. Với đặc tính gây ức chế miễn dịch thì sự lưu hành của FAdV trong đàn gà sẽ là một thách thức mới với người chăn nuôi tại Việt Nam.
Bảng 4.3. Kết quả kiểm tra FAdV ở các lứa tuổi gà
Tuần tuổi Số trại
kiểm tra Số trại (+)
Số mẫu kiểm tra Số mẫu (+) Tỷ lệ mẫu (+) (%) < 3 1 1 8 2 25,00 3 ÷ 5 7 6 72 22 30,56 ≥ 6 6 1 44 2 4,54 Tổng hợp 14 8 124 26 20,97 (+) dương tính; (-): âm tính
Kết quả kiểm tra tỷ lệ dương tính FAdV ở các lứa tuổi gà được trình bày ở bảng 4.3. Như vậy, gà mang virus chủ yếu ở những đàn có lứa tuổi từ 3-5 tuần
tuổi, chiếm tỷ lệ cao nhất (85,71% đàn nhiễm và 30,56% mẫu xét nghiệm dương tính). Đây được coi là lứa tuổi phổ biến mắc bệnh do FAdV gây ra.
Trên thế giới cũng như các nước trong khu vực, FAdV đã được xác định lưu hành và là căn nguyên gây ra các tình trạng bệnh lý ở gà như: loét dạ dày tuyến (Lim et al., 2012), tích nước xoang bao tim (hydropericardium) và viêm gan thể vùi (inclusion body hepatitis) (Choi et al., 2012). Tuy nhiên, ở Việt Nam, theo hiểu biết của chúng tôi, báo cáo này là nghiên cứu đầu tiên về sự lưu hành của FAdV ở đàn gà. Trên cơ sở đó, đã cung cấp cơ sở quan trọng cho các nghiên cứu tiếp theo về tình hình bệnh do FAdV gây ra.
Gà có kết quả dương tính biểu hiện một số bệnh tích như gan, lách xuất huyết, sưng to như minh họa ở hình 4.4 - 4.5.
Hình 4.4. Gan gà sưng to, xuất huyết Hình 4.5. Lách sưng to
4.2. KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GEN HEXON CỦA FAdV 4.2.1. Kết quả phân tích trình tự nucleotide gen hexon của FAdV 4.2.1. Kết quả phân tích trình tự nucleotide gen hexon của FAdV
Trong 26 mẫu dương tính với FAdV, chúng tôi lựa chọn 14 mẫu để tiến hành giải trình tự gen, trong đó có 7 mẫu được giải trình tự thành công (hình 4.6).
Hình 4.6. Kết quả giải trình tự phân đoạn gen hexon của 7 chủng FAdV phân lập
Phân tích giản đồ giải trình tự (chromatogram) của 7 sản phẩm nhân lên bởi cặp mồi FAVHL/FAVHR được tinh sạch, chúng tôi nhận thấy ở mỗi vị trí nucleotide đều có đỉnh tín hiệu rõ ràng. Trên giản đồ trình tự gen được giải mã, ở
mỗi vị trí nucleotide chỉ phát hiện được một đỉnh tín hiệu và không quan sát được sự đa hình nucleotide. Trình tự của đoạn gen hexon của 7 chủng phân lập được trình bày ở hình 4.7.
Hình 4.7. Trình tự gen hexon của 07 chủng FadV
Phân đoạn gen hexon từ nucleotide 361 đến 972. Dấu “.” biểu thị các vị trí có nucleotide giống nhau so với trình tự số 1 (chủng F5).
Kết quả ở hình 4.7 cho nhận xét chung: trình tự gen hexon của 7 chủng FAdV rất đa dạng. Các đặc điểm về trình tự gen của 7 chủng FAdV được tổng hợp như sau: - 24/612 vị trí có đột biến mất nucleotide; 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 .. . . | . . . . | . . . . | . . . . | .. . . | . . . . | . . . . | . . . . | .. . . | . . . . | . . . . | . . . . | .. . . | . . . . | . . . . | . . . . | .. . . | . . . . | . . . . | . . . . | .. . . | . . . . |