Nghiên cứu này đã tìm điều kiện phù hợp nhất của phản ứng PCR phát hiện FAdV bằng cách tối ưu nhiệt độ bắt mồi (hình 4.1) và nồng độ mồi phù hợp (hình 4.2).
Hình 4.1. Tối ưu hóa nhiệt độ bắt mồi của phản ứng PCR
Nhiệt độ bắt mồi được thiết lập biến thiên từ 45,0oC đến 65,6oC. M: 100 bp DNA ladder. Ký hiệu vạch số 1, 3 và 4 là các sản phẩm PCR không đặc hiệu; vạch số 2 là sản phẩm PCR đặc hiệu.
Ở dải nhiệt độ từ 45,0oC đến 46,4oC luôn quan sát được bốn vạch sản phẩm PCR (ký hiệu số 1 - 4, hình 4.1). Trong đó vạch số 2 có kích thước khoảng 731bp là vạch đặc hiệu, các vạch số 1, 3 và 4 có kích thước khoảng 1100bp, 500bp và 300bp là vạch không đặc hiệu (có kích thước không đúng với thiết kế). Ở dải nhiệt độ bắt mồi từ 48,2oC đến 53,0oC số vạch không đặc hiệu giảm xuống (chỉ còn vạch số 1). Chỉ ở nhiệt độ bắt mồi ≥ 55,8oC các vạch không đặc hiệu mới không xuất hiện (hình 4.1).
Về đậm độ của sản phẩm PCR đặc hiệu (vạch số 2), dễ dàng nhận thấy sự tăng dần về độ dày của vạch sản phẩm PCR từ khoảng 45,0oC đến 58,5oC; từ nhiệt độ bắt mồi ≥ 61oC, độ dày vạch sản phẩm PCR giảm xuống rõ rệt. Với hai nhận xét kể trên, chúng tôi chọn nhiệt độ bắt mồi phù hợp là 58,5oC để thực hiện phản ứng PCR. Qua đó cũng thấy rằng việc tối ưu nhiệt độ bắt mồi là vô cùng cần thiết để cho sản phẩm PCR đặc hiệu, với hiệu suất cao nhất. Phản ứng PCR tiếp tục được tối ưu bằng việc điều chỉnh nồng độ mồi xuôi và nồng độ mồi ngược (hình 4.2).
Hình 4.2. Kết quả tối ưu nồng độ mồi của phản ứng PCR
Nồng độ mồi và sự kết hợp nồng độ mồi xuôi và mồi ngược được trình bày ở bảng đi kèm. M là thang ADN chuẩn với khoảng cách giữa các vạch của thang là 100bp.
Dễ dàng nhận thấy chỉ có 5/9 giếng (từ số 1 đến 5) cho vạch sản phẩm đặc hiệu. Các công thức kết hợp mồi khác đều không cho vạch sản phẩm PCR. So sánh đậm độ của các vạch sản phẩm PCR, có thể thấy ở nồng độ mồi xuôi và mồi ngược là 0,5 µM mỗi loại sẽ có mức dương tính mạnh nhất. Từ hình 4.1 và 4.2, chúng tôi rút ra điều kiện tối ưu của phản ứng PCR phát hiện FAdV bằng cặp mồi FAVHL/ FAVHR là: (i) nhiệt độ bắt mồi 58,5oC; (ii) nồng độ mồi cuối cùng là 0,5 µM cho mỗi loại.