Phương pháp xác định độ mẫn cảm của vi khuẩn gây bệnh đối với một số

Một phần của tài liệu (LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và khả năng mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn escherichia coli và salmonella trên thịt lợn bán tại hà nội và bắc ninh (Trang 37)

số thuốc kháng sinh

Thực tế tại nhiều nước, việc sử dụng thuốc kháng sinh không theo chỉ dẫn đã dẫn đến tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng phát triển, gây khó khăn cho công tác điều trị lâm sàng trong nhân y cũng như trong thú y. Trong lâm sàng để lựa chọn thuốc điều trị thích hợp là không dễ dàng. Một trong những hướng lựa chọn thuốc là xét nghiệm xác định độ mẫn cảm của vi khuẩn gây bệnh với một số thuốc kháng sinh hay còn gọi là kỹ thuật kháng sinh đồ.

Kháng sinh đồ là kỹ thuật tìm hiểu và đánh giá độ mẫn cảm của vi khuẩn với các loại kháng sinh, qua đó định hướng cho thầy thuốc sử dụng kháng sinh một cách khoa học; nhằm nâng cao hiệu quả điều trị, hạn chế hiện tượng nhờn thuốc, kháng thuốc của vi khuẩn.

Có nhiều cách để đánh giá độ mẫn cảm của vi khuẩn với thuốc kháng sinh như phương pháp đặt ống trụ, khuếch tán trên thạch,… Trong đó, phổ biến nhất là kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán dựa theo nguyên lý của Kirby-Bauer (Nguyễn Xuân Thành và cs., 2005). Ưu điểm của kỹ thuật này là có thể cùng một lúc thử tác dụng của nhiều loại kháng sinh trên cùng một loại vi khuẩn. Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý khuếch tán kháng sinh từ khoanh giấy vào môi trường thạch. Mức độ khuếch tán phụ thuộc vào phân tử lượng của từng loại kháng sinh và vào độ dày của thạch trên đĩa Petri. Do đó, nồng độ kháng sinh càng gần khoanh giấy thì càng cao, càng xa khoanh giấy càng thấp. Những vùng xung quanh khoanh giấy là vùng ức chế. Đường kính của vòng vô khuẩn càng lớn thì chứng tỏ khả năng mẫn cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh đó càng cao, vi khuẩn đó nhạy cảm với kháng sinh. Ngược lại, nếu đường kính nhỏ hay vi khuẩn mọc sát vào mép khoanh giấy chứng tỏ vi khuẩn đó không nhạy cảm (kháng) với kháng sinh tẩm trong giấy.

PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

- Phòng thí nghiệm Bộ môn Vệ sinh thú y - Viện thú y.

3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

- Từ tháng 10/2017 đến tháng 10/2018.

3.3. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.3.1. Đối tượng nghiên cứu 3.3.1. Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu thịt lợn được thu thập tại một số chợ trên địa bàn Hà Nội và Bắc Ninh. - Vi khuẩn E. coliSalmonella phân lập được từ các mẫu thịt.

3.3.2. Vật liệu nghiên cứu

3.3.2.1. Mẫu xét nghiệm

- Mẫu thịt lợn được thu thập tại một số chợ trên địa bàn Hà Nội và Bắc Ninh.

3.3.2.2. Môi trường và hóa chất

a. Phân lập vi khuẩn E. coli

- Dung dịch pha loãng mẫu Pepton Buffered Water (PBW). - Môi trường Brilliance Selective E. coli/coliform.

- Thạch máu - Nutrient broth - Pepton

- Thuốc thử Kovac’s - Thuốc thử Methyl red

- Môi trường Simmons Citrate - Kít nhuộm gram (Merck) - Môi trường Voges- Proskauer - Glucose

- Lactose

b. Phân lập vi khuẩn Salmonella

Môi trường canh Rappaport - Vassiliadis Soya Pepton (RV) Môi trường Muller Kauffman Tetrathionate (MKTTn) Môi trường Xyloze - Lyzine - Tergitol 4 (XLT4) Môi trường Brilliant Green Agar (BGA)

Môi trường Triple Sugar Iron Agar (TSI)

Môi trường Modified Semi-Solid Rappaport-Vassiliadis Agar (MRSV) Thuốc thử Kovac’s

Môi trường Rambach Lysine

Urea Glucose Lactose

Môi trường Simmons Citrate Kháng huyết thanh Poly OH

c. Môi trường, hóa chất dùng làm kháng sinh đồ

Các loại Khoanh giấy tẩm kháng sinh Thạch Muler - Hinton

Nước muối sinh lý 0,85%

3.3.2.3. Trang thiết bị, dụng cụ

Nồi hấp, tủ ấm, tủ sấy, máy Stomacher, máy li tâm, buồng cấy, máy đo pH, máy đếm khuẩn lạc, máy trộn Voltex …

Bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, cốc đong, ống đong, phễu, pipet, đèn cồn, que cấy, túi đựng mẫu, thước đo vòng vô khuẩn…

Tất cả các dụng cụ, hóa chất, môi trường nuôi cấy, môi trường phân lập và giám định vi khuẩn đều phải vô trùng tuyệt đối trước khi sử dụng.

3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Phân lập xác định tỷ lệ ô nhiễm của vi khuẩn E.coliSalmonella trên thịt lợn thu thập tại một số chợ nhỏ lẻ ở địa bàn Hà Nội và Bắc Ninh

- Xác định khả năng mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn E. coli

trong chương trình kiểm soát vi khuẩn kháng thuốctheo tiêu chuẩn quốc tế.

3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Phương pháp thu thập mẫu 3.5.1. Phương pháp thu thập mẫu

Mẫu thịt lợn được thu thập theo TCVN4833-2:2002 về quy trình thu thập mẫu thực phẩm dùng để xét nghiệm vi sinh vật

Dụng cụ:

+ Túi bóng trắng, túi bóng kính, túi bóng đen + Giấy dán nhãn, bút viết kính, băng dính + Thùng xốp, đá khô

- Cách tiến hành:

+ Thời gian lấy: 6-7 giờ sáng

- Thu thập mẫu tại các quầy bán thịt trong chợ truyền thống - Mỗi 1 chợ lấy 3 - 4 mẫu (mỗi mẫu từ 300 - 500 g/mẫu). - Mẫu được đựng trong một túi nilong vô trùng.

- Tất cả các túi mẫu thu thập được bảo quản trong thùng đá khô, giữ ở điều kiện lạnh 4oC và vận chuyển về phòng thí nghiệm để phân lập vi khuẩn ngay trong ngày. .

3.5.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn E. coli theo TCVN 7924-2 : 2008 (ISO 16649-2 : 2001) 16649-2 : 2001)

- Cân 10g mẫu thịt lợn đã được nghiền nhỏ vào túi dập mẫu chứa 90ml dung dịch Buffer Pepton water.

- Tiếp tục pha loãng mẫu theo dãy nồng độ từ 10-1 đến 10-8.

- Cấy láng đều 100µl dung dịch từ mỗi ống của dãy pha loãng trên mặt đĩa thạchBrilliance E.coli/Coliform Selective medium (Oxoid) bằng bi thủy tinh (mỗi nồng độ pha loãng cấy 2 đĩa).

- Nuôi cấy vi khuẩn ở nhiệt độ 37°C/ 24h. Quan sát các khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch, lựa chọn những khuẩn lạc có màu xanh tím đồng nhất hoặc nhân tím, tròn trơn, hơi lồi. Đây là những khuẩn lạc của vi khuẩn E. coli.

Tiến hành thử nghiệm IMViC:

+ Phản ứng sinh Indole: Cấy vi khuẩn vào môi trường nước peptone. Ủ ở 37oC trong 24 - 48 giờ. Nhỏ 1ml thuốc thử Kovac’s vào ống môi trường. Phản

ứng (+) lớp thuốc thử trên mặt môi trường có màu đỏ.

+ Phản ứng với đỏ methyl (Methyl red): Cấy vi khuẩn vào môi trường nước peptone glucose. Ủ ở 37oC trong 2 - 4 ngày. Nhỏ 5 giọt thuốc thử đỏ methyl vào ống môi trường. Phản ứng (+)màu đỏ.

+ Phản ứng Voges Proskauer: Cấy vi khuẩn vào môi trường nước peptone glucose. Ủ ở 37oC trong 48 giờ. Chuyển 1ml canh trùng sang 1 ống nghiệm khác. Nhỏ vào 0,6ml dung dịch cồn α-naptol, 0,2ml dung dịch Kalihydroxide 40%, lắc đều. Đọc kết quả sau 5 - 15 phút: Phản ứng (+): màu dỏ.

+ Trên môi trường thạch Simmons Citrate: Ria cấy vi khuẩn trên mặt thạch nghiêng. Ủ ở 37oC trong 1 - 3 ngày. E. coli không mọc trên môi trường

- Đếm số lượng khuẩn lạc của vi khuẩn E. coli/Coliform (khuẩn lạc của

Coliform có màu hồng đồng nhất hoặc nhân hồng đặc trưng). Ghi lại kết quả và

tính toán theo công thức:

N= ∑

, (CFU)

Trong đó:

N - số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu huyền phù ban đầu C - số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri đã chọn n1,n2 - số hộp peptri ở hai độ pha loãng liên tiếp đã chọn

d - hệ số pha loãng mẫu tương ứng với hộp peptri đã chọn thứ nhất

Phương pháp giữ giống vi khuẩn E. coli phân lập được

Chọn khuẩn lạc E. coli từ mỗi mẫu ria cấy riêng biệt sang đĩa thạch máu, nuôi cấy 37°C /24h. Lưu giữ các chủng vi khuẩn ở nhiệt độ -80C trong ống giữ giống chứa 2ml Lauria-Bertani broth (BD Sparks, USA), phosphate buffered saline bổ sung 4.4% glycerol để xét nghiệm tính mẫn cảm kháng sinh.

3.5.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn Salmonella theo TCVN 4829 : 2005 (ISO 6579 : 2002) (ISO 6579 : 2002)

Bước 1: Tăng sinh không chọn lọc

Lấy 25g mẫu cắt nhỏ bằng kéo vô trùng và cho vào túi dập mẫu Cho dung dịch đệm Buffer Pepton water theo tỉ lệ 1/10 (225ml PBW) Đồng nhất mẫu với môi trường bằng máy dập mẫu (Stomacher) trong 1 phút với tốcđộ 230 vòng/ phút

Nuôi cấy trong tủ ấm 37oC/ 16-18h.

Bước 2: Tăng sinh chọn lọc

Dùng pipet vô trùng hút 1-1.2ml dung dịch tăng sinh không chọn lọc, nhỏ 3giọt(0.1ml) vào thạch bán cố thể MSRV

Nuôi cấy trong tủ ấm 41.50C/24-48h

Phần còn lại cho vào ống nghiệm có chứa 9ml môi trường Muller Kauffmann

Dùng máy (voltex) lắc đều, để vào tủ ấm 370C/18-24h.

Đọc kết quả: Trên môi trường MSRV vi khuẩn mọc lan ra xung quanh giọt canh khuẩn. Ở môi trường Muller Kauffmann hỗn dịch có thể biến đổi màu sắc.

Bước 3: Phân lập trên các môi trường chọn lọc

Dùng que cấy có đường kính 1μm lấy 1 vòng canh trùng từ môi trường MSRV (lấy ở vị trí vi khuẩn lan xa nhất) ria cấy sang đĩa thạch Rambach

Để tủ ấm 370C/18 - 24h

Đọc kết quả: Khuẩn lạc Salmonella tròn trơn, nhẵn bóng, có màu đỏ hoặc hồng cánh sen.

Dùng que cấy có đường kính 10μm lấy 1 vòng canh trùng từ ống tăng sinh Muller Kauffmann (trước khi lấy phải dùng máy lắc đều hỗn dịch trong ống) ria cấy sang đĩa thạch XLT4. Cấy làm 3 đường cấy và thưa dần để tách khuẩn lạc riêng rẽ.

Để tủ ấm 370C/18 - 24h

Khuẩn lạc Salmonella tròn, bóng lồi lên trên bề mặt thạch, có màu đen.

3.5.4. Phương pháp kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng

E. coliSalmonella phân lập được

Sử dụng phương pháp của Kirby- Bauer và đánh giá kết quả thử khả năng mẫn cảm của vi khuẩn với các loại kháng sinh dựa vào bảng đánh giá kết quả tiêu chuẩn thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh M100-S24 (Wayne, 2014). Vi khuẩn phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm cấy sang môi trường thạch ống nghiêng NA, để 370C/24h. Lấy sinh khối vi khuẩn cho vào 9ml dung dịch NaCl 0,9% vô trùng, lắc đều và điều chỉnh để có độ đục Mc Farland 0,5. Sau đó, lấy tăm bông vô trùng thấm huyễn dịch vi khuẩn trải đều trên bề mặt đĩa thạch Muller - Hinton

(MH). Đặt đĩa giấy tẩm kháng sinh lên bề mặt đĩa thạch đã được trải trùng, mỗi đĩa thạch đặt 5-6 khoanh giấy tẩm kháng sinh. Để 370C/18 - 24h.

Các loại kháng sinh được sử dụng ở Bảng 3.1 dưới đây. Các bước tiến hành như sau:

+ Bước 1: Chuẩn bị môi trường thạch Muller - Hinton.

+ Bước 2: Các chủng vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường thích hợp được dàn đều lên môi trường thạch đĩa Muller - Hinton.

+ Bước 3: Giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxoid được đặt khoảng cách đều nhau trong đĩa.

+ Bước 4: Bồi dưỡng ở 370C trong 18 - 24h, đo đường kính vòng vô khuẩn để đánh giá mức độ nhạy cảm hay kháng kháng sinh của vi khuẩn.

Kết quả được đọc bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn để xác định tính mẫn cảm hay đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh tương ứng tại bảng 3.1:

Bảng 3.1. Bảng đánh giá đường kính vòng vô khuẩn của một số kháng sinh dùng trong nghiên cứu

STT Tên kháng sinh Ký hiệu mã hóa Lượng kháng sinh (µg) Đường kính vòng vô khuẩn (mm) R I S 1 Ampicillin AMP 10 ≤13 14-16 ≥17 2 Tetracycline TE 30 ≤11 12-14 ≥15 3 Chloramphenicol C 30 ≤12 13-17 ≥18 4 Cefotaxime CTX 30 ≤22 23-25 ≥26 5 Ceftazidime CAZ 30 ≤17 18-20 ≥21 6 Trimethoprim W 05 <10 11-15 ≥16 7 Sulfonamides S3 300 ≤12 13-16 ≥17 8 Gentamicin CN 10 ≤12 13-14 ≥15 9 Ciprofloxacin CIP 05 ≤15 16-20 ≥21 10 Nalidixic acid NA 30 ≤13 14-18 ≥19 11 Colistin CT 10 ≤10 - ≥11 Ghi chú: S (Susceptible): Rất mẫn cảm I (Intermediate): Mẫn cảm trung bình R (Resistant): Kháng

Các loại kháng sinh được chọn để kiểm tra khả năng mẫn cảm của vi khuẩn E. coliSalmonella trong nghiên cứu này dựa theo tiêu chuẩn của Quốc tế về danh mục kháng sinh cần kiểm soát đối với vi khuẩn kháng thuốc (DANMAP, 2017).

3.5.5. Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu thu thập được xử lý theo phương pháp thống kê vi sinh vật học. Sử dụng chương trình máy tính, phần mềm Excel 2007

Tỷ lệ dương tính (%)= Số mẫu dương tính

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. KẾT QUẢ XÁC ĐI ̣NH TỶ LỆ NHIỄM E. COLI VÀ SALMONELLA

TRONG THI ̣T LỢN TẠI HÀ NỘI VÀ BẮC NINH

4.1.1. Thực trạng ô nhiễm vi khuẩn E. coli trên thịt lợn tại Hà Nội và Bắc Ninh

Sau khi tiến hành phân lập vi khuẩn E. coli từ 80 mẫu thịt lợn thu thập tại các chợ nhỏ lẻ trên địa bàn Hà Nội và Bắc Ninh thu được kết quả thể hiện ở bảng 4.1.

Bảng 4.1. Kết quả phát hiện và đếm số vi khuẩn E. coli trong mẫu thịt lợn thu thập tại chợ nhỏ lẻ ở Hà Nội và Bắc Ninh

Địa điểm lấy mẫu Số mẫu (n) Mẫu dương tính Tỷ lệ (%) Không đạt Đạt* Số mẫu Tỷ lệ (%) Số mẫu Tỷ lệ (%) Bắc Ninh 40 39 97,5 38 95 2 5 Hà Nội 40 39 97,5 38 95 2 5 Tổng 80 78 97,5 76 95 4 5

Ghi chú *: Đạt tiêu chuẩn vệ sinh thú y theo TCVN 7046 :2009

Kết quả cho thấy, trong số 80 mẫu thịt kiểm tra có 78 mẫu phân lập được vi khuẩn E. coli chiếm tỷ lệ 97,5%. Điều đó phản ánh tình trạng vệ sinh tại các cơ sở giết mổ, tại các chợ cũng như vệ sinh trong quá trình vận chuyển còn nhiều hạn chế đã làm ảnh hưởng đến chất lượng vi sinh của thực phẩm. Theo kết qủa nghiên cứu của Nguyễn Quang Tuyên và Lê Xuân Thăng (2008) tỷ lệ mẫu thịt nhiễm E. coli sau khi giết mổ 1-2 giờ là 95,53%, sau 4-5 giờ là 97,26% và sau 8 - 9 giờ là 100%. Kết quả phân lập vi khuẩn E. coli từ 90 mẫu thịt lấy tại một số huyện ngoại thành Hà Nội cũng cho biết 75 mẫu nhiễm E. coli (Trần Thị Hương Giang và Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2012).

Trong số 78 mẫu phân lập được vi khuẩn E. coli có 76 mẫu không đạt tiêu chuẩn vệ sinh (> 102 CFU/ml). Như vậy trong 80 mẫu thịt lợn kiểm tra có 76 mẫu không đảm bảo tiêu chuẩn vệ sinh cho phép, chiếm tỷ lệ 95% và 04 mẫu đảm bảo tiêu chuẩn vệ sinh chiếm tỷ lệ 05%.Qua đó cho thấy tỷ lệ nhiễm E. coli là khá cao so với chỉ tiêu cho phép, rất dễ gây ngộ độc thực phẩm cho người tiêu dùng.

Tỷ lệ (%) số mẫu nhiễm E. coli và số mẫu không đạt theoTCVN 7046:2009 giữa các địa phương được thể hiện ở Hình 4.1.

Hình 4.1. Tỷ lệ % số mẫu nhiễm với vi khuẩn E. coli và số mẫu không đạt theo TCVN 7046:2009 tại Hà Nội và Bắc Ninh

Từ Hình 4.1 cho thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn và tỷ lệ mẫu không đạt theo TCVN 7046:2009 của E. coli trên các mẫu thịt lấy tại Hà Nội và Bắc Ninh là tương đương và đều ở mức rất cao. Thực tế, thịt lợn thường được cung cấp từ các lò mổ chưa được đầu tư đầy đủ để đảm bảo vệ sinh thú y. Việc vận chuyển tiêu thụ thịt lợn trên các phương tiện thô sơ không đủ tiêu chuẩn vệ sinh thú y và bày bán tại chợ hoặc tụ điểm tự phát là nguy cơ cao gây ảnh hưởng lớn đến chất lượng thịt lợn.

Trong quá trình tiến hành thu thập mẫu thịt lợn bán tại chợ trên địa bàn Hà Nội và Bắc Ninh vào lúc 6-7 giờ sáng, chúng tôi đã quan sát thấy thịt lợn được vận chuyển đến chợ bằng các phương tiện thô sơ, thịt không được bỏ trong thùng kín mà được vận chuyển cả thân thịt hoặc một phần thân thịt trên xe không được che chắn, phương tiện chuyên chở không được vệ sinh trước trong và sau vận chuyển nên rất mất vệ sinh. Tại các chợ hạ tầng cơ sở đang ngày càng xuống cấp, các gian hàng lắp ghép tạm bợ, sập xệ, hệ thống đường đi chật chội, chưa có hệ thống thu gom, xử lý các loại rác thải gây ô nhiễm, các loại thực phẩm tươi sống được bày bán xen lẫn với thực phẩm chín, không có biện pháp bảo vệ trước các loại côn trùng, các loại động vật gây mất vệ sinh, thậm chí có những loại thực phẩm được bày bán ngay tại lề đường, nơi lượng xe cộ, người qua lại lớn gây ảnh

Một phần của tài liệu (LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và khả năng mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn escherichia coli và salmonella trên thịt lợn bán tại hà nội và bắc ninh (Trang 37)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(75 trang)