3.5.1. Phương pháp thu thập mẫu
Mẫu thịt lợn được thu thập theo TCVN4833-2:2002 về quy trình thu thập mẫu thực phẩm dùng để xét nghiệm vi sinh vật
Dụng cụ:
+ Túi bóng trắng, túi bóng kính, túi bóng đen + Giấy dán nhãn, bút viết kính, băng dính + Thùng xốp, đá khô
- Cách tiến hành:
+ Thời gian lấy: 6-7 giờ sáng
- Thu thập mẫu tại các quầy bán thịt trong chợ truyền thống - Mỗi 1 chợ lấy 3 - 4 mẫu (mỗi mẫu từ 300 - 500 g/mẫu). - Mẫu được đựng trong một túi nilong vô trùng.
- Tất cả các túi mẫu thu thập được bảo quản trong thùng đá khô, giữ ở điều kiện lạnh 4oC và vận chuyển về phòng thí nghiệm để phân lập vi khuẩn ngay trong ngày. .
3.5.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn E. coli theo TCVN 7924-2 : 2008 (ISO 16649-2 : 2001) 16649-2 : 2001)
- Cân 10g mẫu thịt lợn đã được nghiền nhỏ vào túi dập mẫu chứa 90ml dung dịch Buffer Pepton water.
- Tiếp tục pha loãng mẫu theo dãy nồng độ từ 10-1 đến 10-8.
- Cấy láng đều 100µl dung dịch từ mỗi ống của dãy pha loãng trên mặt đĩa thạchBrilliance E.coli/Coliform Selective medium (Oxoid) bằng bi thủy tinh (mỗi nồng độ pha loãng cấy 2 đĩa).
- Nuôi cấy vi khuẩn ở nhiệt độ 37°C/ 24h. Quan sát các khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch, lựa chọn những khuẩn lạc có màu xanh tím đồng nhất hoặc nhân tím, tròn trơn, hơi lồi. Đây là những khuẩn lạc của vi khuẩn E. coli.
Tiến hành thử nghiệm IMViC:
+ Phản ứng sinh Indole: Cấy vi khuẩn vào môi trường nước peptone. Ủ ở 37oC trong 24 - 48 giờ. Nhỏ 1ml thuốc thử Kovac’s vào ống môi trường. Phản
ứng (+) lớp thuốc thử trên mặt môi trường có màu đỏ.
+ Phản ứng với đỏ methyl (Methyl red): Cấy vi khuẩn vào môi trường nước peptone glucose. Ủ ở 37oC trong 2 - 4 ngày. Nhỏ 5 giọt thuốc thử đỏ methyl vào ống môi trường. Phản ứng (+)màu đỏ.
+ Phản ứng Voges Proskauer: Cấy vi khuẩn vào môi trường nước peptone glucose. Ủ ở 37oC trong 48 giờ. Chuyển 1ml canh trùng sang 1 ống nghiệm khác. Nhỏ vào 0,6ml dung dịch cồn α-naptol, 0,2ml dung dịch Kalihydroxide 40%, lắc đều. Đọc kết quả sau 5 - 15 phút: Phản ứng (+): màu dỏ.
+ Trên môi trường thạch Simmons Citrate: Ria cấy vi khuẩn trên mặt thạch nghiêng. Ủ ở 37oC trong 1 - 3 ngày. E. coli không mọc trên môi trường
- Đếm số lượng khuẩn lạc của vi khuẩn E. coli/Coliform (khuẩn lạc của
Coliform có màu hồng đồng nhất hoặc nhân hồng đặc trưng). Ghi lại kết quả và
tính toán theo công thức:
N= ∑
, (CFU)
Trong đó:
N - số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu huyền phù ban đầu C - số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri đã chọn n1,n2 - số hộp peptri ở hai độ pha loãng liên tiếp đã chọn
d - hệ số pha loãng mẫu tương ứng với hộp peptri đã chọn thứ nhất
Phương pháp giữ giống vi khuẩn E. coli phân lập được
Chọn khuẩn lạc E. coli từ mỗi mẫu ria cấy riêng biệt sang đĩa thạch máu, nuôi cấy 37°C /24h. Lưu giữ các chủng vi khuẩn ở nhiệt độ -80C trong ống giữ giống chứa 2ml Lauria-Bertani broth (BD Sparks, USA), phosphate buffered saline bổ sung 4.4% glycerol để xét nghiệm tính mẫn cảm kháng sinh.
3.5.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn Salmonella theo TCVN 4829 : 2005 (ISO 6579 : 2002) (ISO 6579 : 2002)
Bước 1: Tăng sinh không chọn lọc
Lấy 25g mẫu cắt nhỏ bằng kéo vô trùng và cho vào túi dập mẫu Cho dung dịch đệm Buffer Pepton water theo tỉ lệ 1/10 (225ml PBW) Đồng nhất mẫu với môi trường bằng máy dập mẫu (Stomacher) trong 1 phút với tốcđộ 230 vòng/ phút
Nuôi cấy trong tủ ấm 37oC/ 16-18h.
Bước 2: Tăng sinh chọn lọc
Dùng pipet vô trùng hút 1-1.2ml dung dịch tăng sinh không chọn lọc, nhỏ 3giọt(0.1ml) vào thạch bán cố thể MSRV
Nuôi cấy trong tủ ấm 41.50C/24-48h
Phần còn lại cho vào ống nghiệm có chứa 9ml môi trường Muller Kauffmann
Dùng máy (voltex) lắc đều, để vào tủ ấm 370C/18-24h.
Đọc kết quả: Trên môi trường MSRV vi khuẩn mọc lan ra xung quanh giọt canh khuẩn. Ở môi trường Muller Kauffmann hỗn dịch có thể biến đổi màu sắc.
Bước 3: Phân lập trên các môi trường chọn lọc
Dùng que cấy có đường kính 1μm lấy 1 vòng canh trùng từ môi trường MSRV (lấy ở vị trí vi khuẩn lan xa nhất) ria cấy sang đĩa thạch Rambach
Để tủ ấm 370C/18 - 24h
Đọc kết quả: Khuẩn lạc Salmonella tròn trơn, nhẵn bóng, có màu đỏ hoặc hồng cánh sen.
Dùng que cấy có đường kính 10μm lấy 1 vòng canh trùng từ ống tăng sinh Muller Kauffmann (trước khi lấy phải dùng máy lắc đều hỗn dịch trong ống) ria cấy sang đĩa thạch XLT4. Cấy làm 3 đường cấy và thưa dần để tách khuẩn lạc riêng rẽ.
Để tủ ấm 370C/18 - 24h
Khuẩn lạc Salmonella tròn, bóng lồi lên trên bề mặt thạch, có màu đen.
3.5.4. Phương pháp kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng
E. coli và Salmonella phân lập được
Sử dụng phương pháp của Kirby- Bauer và đánh giá kết quả thử khả năng mẫn cảm của vi khuẩn với các loại kháng sinh dựa vào bảng đánh giá kết quả tiêu chuẩn thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh M100-S24 (Wayne, 2014). Vi khuẩn phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm cấy sang môi trường thạch ống nghiêng NA, để 370C/24h. Lấy sinh khối vi khuẩn cho vào 9ml dung dịch NaCl 0,9% vô trùng, lắc đều và điều chỉnh để có độ đục Mc Farland 0,5. Sau đó, lấy tăm bông vô trùng thấm huyễn dịch vi khuẩn trải đều trên bề mặt đĩa thạch Muller - Hinton
(MH). Đặt đĩa giấy tẩm kháng sinh lên bề mặt đĩa thạch đã được trải trùng, mỗi đĩa thạch đặt 5-6 khoanh giấy tẩm kháng sinh. Để 370C/18 - 24h.
Các loại kháng sinh được sử dụng ở Bảng 3.1 dưới đây. Các bước tiến hành như sau:
+ Bước 1: Chuẩn bị môi trường thạch Muller - Hinton.
+ Bước 2: Các chủng vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường thích hợp được dàn đều lên môi trường thạch đĩa Muller - Hinton.
+ Bước 3: Giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxoid được đặt khoảng cách đều nhau trong đĩa.
+ Bước 4: Bồi dưỡng ở 370C trong 18 - 24h, đo đường kính vòng vô khuẩn để đánh giá mức độ nhạy cảm hay kháng kháng sinh của vi khuẩn.
Kết quả được đọc bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn để xác định tính mẫn cảm hay đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh tương ứng tại bảng 3.1:
Bảng 3.1. Bảng đánh giá đường kính vòng vô khuẩn của một số kháng sinh dùng trong nghiên cứu
STT Tên kháng sinh Ký hiệu mã hóa Lượng kháng sinh (µg) Đường kính vòng vô khuẩn (mm) R I S 1 Ampicillin AMP 10 ≤13 14-16 ≥17 2 Tetracycline TE 30 ≤11 12-14 ≥15 3 Chloramphenicol C 30 ≤12 13-17 ≥18 4 Cefotaxime CTX 30 ≤22 23-25 ≥26 5 Ceftazidime CAZ 30 ≤17 18-20 ≥21 6 Trimethoprim W 05 <10 11-15 ≥16 7 Sulfonamides S3 300 ≤12 13-16 ≥17 8 Gentamicin CN 10 ≤12 13-14 ≥15 9 Ciprofloxacin CIP 05 ≤15 16-20 ≥21 10 Nalidixic acid NA 30 ≤13 14-18 ≥19 11 Colistin CT 10 ≤10 - ≥11 Ghi chú: S (Susceptible): Rất mẫn cảm I (Intermediate): Mẫn cảm trung bình R (Resistant): Kháng
Các loại kháng sinh được chọn để kiểm tra khả năng mẫn cảm của vi khuẩn E. coli và Salmonella trong nghiên cứu này dựa theo tiêu chuẩn của Quốc tế về danh mục kháng sinh cần kiểm soát đối với vi khuẩn kháng thuốc (DANMAP, 2017).
3.5.5. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thu thập được xử lý theo phương pháp thống kê vi sinh vật học. Sử dụng chương trình máy tính, phần mềm Excel 2007
Tỷ lệ dương tính (%)= Số mẫu dương tính
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ XÁC ĐI ̣NH TỶ LỆ NHIỄM E. COLI VÀ SALMONELLA
TRONG THI ̣T LỢN TẠI HÀ NỘI VÀ BẮC NINH
4.1.1. Thực trạng ô nhiễm vi khuẩn E. coli trên thịt lợn tại Hà Nội và Bắc Ninh
Sau khi tiến hành phân lập vi khuẩn E. coli từ 80 mẫu thịt lợn thu thập tại các chợ nhỏ lẻ trên địa bàn Hà Nội và Bắc Ninh thu được kết quả thể hiện ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả phát hiện và đếm số vi khuẩn E. coli trong mẫu thịt lợn thu thập tại chợ nhỏ lẻ ở Hà Nội và Bắc Ninh
Địa điểm lấy mẫu Số mẫu (n) Mẫu dương tính Tỷ lệ (%) Không đạt Đạt* Số mẫu Tỷ lệ (%) Số mẫu Tỷ lệ (%) Bắc Ninh 40 39 97,5 38 95 2 5 Hà Nội 40 39 97,5 38 95 2 5 Tổng 80 78 97,5 76 95 4 5
Ghi chú *: Đạt tiêu chuẩn vệ sinh thú y theo TCVN 7046 :2009
Kết quả cho thấy, trong số 80 mẫu thịt kiểm tra có 78 mẫu phân lập được vi khuẩn E. coli chiếm tỷ lệ 97,5%. Điều đó phản ánh tình trạng vệ sinh tại các cơ sở giết mổ, tại các chợ cũng như vệ sinh trong quá trình vận chuyển còn nhiều hạn chế đã làm ảnh hưởng đến chất lượng vi sinh của thực phẩm. Theo kết qủa nghiên cứu của Nguyễn Quang Tuyên và Lê Xuân Thăng (2008) tỷ lệ mẫu thịt nhiễm E. coli sau khi giết mổ 1-2 giờ là 95,53%, sau 4-5 giờ là 97,26% và sau 8 - 9 giờ là 100%. Kết quả phân lập vi khuẩn E. coli từ 90 mẫu thịt lấy tại một số huyện ngoại thành Hà Nội cũng cho biết 75 mẫu nhiễm E. coli (Trần Thị Hương Giang và Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2012).
Trong số 78 mẫu phân lập được vi khuẩn E. coli có 76 mẫu không đạt tiêu chuẩn vệ sinh (> 102 CFU/ml). Như vậy trong 80 mẫu thịt lợn kiểm tra có 76 mẫu không đảm bảo tiêu chuẩn vệ sinh cho phép, chiếm tỷ lệ 95% và 04 mẫu đảm bảo tiêu chuẩn vệ sinh chiếm tỷ lệ 05%.Qua đó cho thấy tỷ lệ nhiễm E. coli là khá cao so với chỉ tiêu cho phép, rất dễ gây ngộ độc thực phẩm cho người tiêu dùng.
Tỷ lệ (%) số mẫu nhiễm E. coli và số mẫu không đạt theoTCVN 7046:2009 giữa các địa phương được thể hiện ở Hình 4.1.
Hình 4.1. Tỷ lệ % số mẫu nhiễm với vi khuẩn E. coli và số mẫu không đạt theo TCVN 7046:2009 tại Hà Nội và Bắc Ninh
Từ Hình 4.1 cho thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn và tỷ lệ mẫu không đạt theo TCVN 7046:2009 của E. coli trên các mẫu thịt lấy tại Hà Nội và Bắc Ninh là tương đương và đều ở mức rất cao. Thực tế, thịt lợn thường được cung cấp từ các lò mổ chưa được đầu tư đầy đủ để đảm bảo vệ sinh thú y. Việc vận chuyển tiêu thụ thịt lợn trên các phương tiện thô sơ không đủ tiêu chuẩn vệ sinh thú y và bày bán tại chợ hoặc tụ điểm tự phát là nguy cơ cao gây ảnh hưởng lớn đến chất lượng thịt lợn.
Trong quá trình tiến hành thu thập mẫu thịt lợn bán tại chợ trên địa bàn Hà Nội và Bắc Ninh vào lúc 6-7 giờ sáng, chúng tôi đã quan sát thấy thịt lợn được vận chuyển đến chợ bằng các phương tiện thô sơ, thịt không được bỏ trong thùng kín mà được vận chuyển cả thân thịt hoặc một phần thân thịt trên xe không được che chắn, phương tiện chuyên chở không được vệ sinh trước trong và sau vận chuyển nên rất mất vệ sinh. Tại các chợ hạ tầng cơ sở đang ngày càng xuống cấp, các gian hàng lắp ghép tạm bợ, sập xệ, hệ thống đường đi chật chội, chưa có hệ thống thu gom, xử lý các loại rác thải gây ô nhiễm, các loại thực phẩm tươi sống được bày bán xen lẫn với thực phẩm chín, không có biện pháp bảo vệ trước các loại côn trùng, các loại động vật gây mất vệ sinh, thậm chí có những loại thực phẩm được bày bán ngay tại lề đường, nơi lượng xe cộ, người qua lại lớn gây ảnh hưởng không nhỏ tới chất lượng. Thịt lợn được bày bán trên mặt bàncó mặt bàn bằng gỗ, có mặt bàn ốp bằng đá, mặt bàn bọc bằng inox, nhưng sau đó người bán hàng còn lót thêm lên mặt bàn tấm bìa cát tông, miếng rẻ để thấm nước, chất bẩn bám dính khắp nơi, dao chặt thịt lợn có quầy dùng dao inox, có quầy dùng dao
93.5 94 94.5 95 95.5 96 96.5 97 97.5 Hà Nội Bắc Ninh 97.5 97.5 95 95 Tỷ lệ %
Tỷ lệ mẫu nhiễm vi khuẩn E. coli
bằng sắt, tuy nhiên, mỗi quầy chỉ dùng một dao, một thớt để chặt thịt lợn suốt cả buổi bán, hết buổi bán chỉ dọn dẹp lau chùi sơ khu bày bán, mặt bàn và dao thớt. Đó cũng là nguyên nhân dẫn đến tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E. coli và Salmonella giữa các thân thịt cho người tiêu dùng sử dụng sản phẩm thịt lợn được mua từ chợ.Tiềm ẩn nguy cơ ngộ độc thực phẩm làm ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng và giảm tiêu thụ thực phẩm có nguồn gốc động vật.
Cần thiết thực hiện việc ngăn chặn và hạn chế sự lây nhiễm vi khuẩn E.
coli vào sản phẩm thịt ngay từ khâu giết mổ phải thực hiện đúng quy trình giết
mổ, thu gom và xử lý chất thải, thường xuyên vệ sinh nguồn nước và dụng cụ. Các quầy bán thịt ở chợ cần tuân thủ đầy đủ cácquy định về vệ sinh dụng cụ bày bán, dụng cụ bảo hộ và tình hình sức khỏe của người bán thịt. Nhân công tham gia giết mổ và buôn bán sản phẩm cần được tham gia các lớp tập huấn về vệ sinh an toàn thực phẩm nguồn gốc động vật.
Chúng tôi cũng đã tiến hành kiểm tra đặc tính sinh hóa của một số chủng
E. coli được chọn ngẫu nhiên từ các mẫu dương tính. Kết quả được trình bày tại
Bảng 4.2.
Bảng 4.2. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hoá của một số chủng
E. coli phân lập
STT Chỉ tiêu kiểm tra Đối
chứng Số chủng thử (n) Số chủng dương tính Tỷ lệ % dương tính
1 Tı́nh chất nhuô ̣m màu Gram âm Gram(-) 50 50 100
2 Sinh H2S H2S 52 0 0
3 Lên men Lactose + 52 52 100
4 Lên men Glucose + 52 52 100
5 Indole + 55 55 100
6 Methyl Red + 50 50 100
7 Voges- Proskauer - 50 0 0
8 Citrate - 50 0 0
Kết quả cho thấy toàn bộ các chủng được thử mang đầy đủ dặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli. Như sinh Indole, tạo và duy trì acid được sinh ra từ quá trình lên men glucose trong phản ứng Methyl red, không có khả năng sinh acetylmethylcarbinol (acetoin) trong phản ứng Voges- Proskauer và không sử
dụng được nguồn carbon của citrate trong môi trường thạch Simmon Citrate. Trong môi trường TSI vi khuẩn E. coli không sinh ra H2S, lên men đường Glucose và Lactose.
Hình 4.2. Khuẩn lạc vi khuẩn E. coli có màu xanh tím đặc trưng trên đĩa thạch Brilliance E.coli/Coliform Selective medium
Hình 4.3. Phản ứng Indol của vi khuẩn E.coli
4.1.2. Kết quả phát hiện vi khuẩn Salmonella ô nhiễm trên thịt lợn tại Hà Nội và Bắc Ninh Nội và Bắc Ninh
Trong nhóm các vi khuẩn gây bệnh truyền qua thực phẩm, các nhà khoa học đã đặt mối quan tâm nhiều nhất đối với vi khuẩn Salmonella. Từ trước đến nay,
Salmonella vẫn được xem là vi sinh vật đóng vai trò quan trọng đối với sức khỏe
cộng đồng trên phạm vi toàn thế giới. Vi khuẩn Salmonella nguy hiểm vì ngoài khả năng gây bệnh cả cho người và động vật, nó còn là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm ở người. Vi khuẩn Salmonella có thể sinh trưởng ở thực phẩm nhưng không sinh độc tố, khi vào trong ruột hoặc vào máu mới sinh độc tố, gây viêm niêm mạc
ruột, khi vi khuẩn chết đi tự phân giải và giải phóng độc tố. Chỉ cần với một lượng nhỏ vi khuẩn trong thực phẩm cũng có thể khuếch tán ra môi trường và gây bệnh cho người và gia súc. Vì vậy, yêu cầu vệ sinh thực phẩm đối với loại vi khuẩn này rất nghiêm ngặt. Theo TCVN 7046:2009 đã quy định không cho phép Salmonella có mặt trong 25g thịt.
Kết quả xác định mức độ ô nhiểm vi khuẩn Salmonella trên các mẫu thịt lợn được trình bày ở Bảng 4.3 và Hình 4.4.
Bảng 4.3. Kết quả phát hiện vi khuẩn Salmonella trong các mẫu thịt lợn thu thập tại chợ nhỏ lẻ ở Hà Nội và Bắc Ninh
Địa điểm lấy mẫu Số mẫu