Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.2. Đánh giá chất lượng nước khoáng Mỹ An
Mẫu nước khống được lấy trực tiếp từ vịi chảy bơm từ trong lịng nguồn suối khống, đem đóng chai, ghi nhãn và gửi mẫu đi phân tích các thành phần hóa học có bên trong nguồn nước.
Hình 3.2. Vị trí lấy mẫu phân tích tại Mỹ An, Phú Vang, Thừa thiên Huế 3.3.3. Xây dựng quy trình ni thực nghiệm thu sinh khối tảo 3.3.3. Xây dựng quy trình ni thực nghiệm thu sinh khối tảo
Quy trình ni thực nghiệm thu sinh khối tảo tại Công ty cổ phân du lịch Mỹ An Thừa Thiên – Huế dựa trên các nghiên cứu khác thuộc đề tài “Nghiên
cứu tận dụng nguồn nước suối khoáng tại Thừa Thiên Huế để sản xuất Spirulina làm thực phẩm chức năng”, như sau:
a. Chuẩn bị hệ thống nuôi sinh khối
- Thiết bị:
Bảng 4.1. Danh sách thiết bị sử dụng
STT Thiết bị
1 Bàn thao tác
2 Bơm nhúng chìm Wilo cơng suất 400W 3 Bơm nước thường selton SEL công suất 150W 4 Máy sục ozon BK
5 Guồng quay
8 Mô tơ
9 Tank chứa nước 3m3 10 Lưới thu
10 Thùng nhựa 220L 11 Sục khí bể nhân giống 12 Quả sục khí
- Quy mơ pilot (bể tảo 20m2): Tại Công ty cổ phần du lịch Mỹ An Thừa Thiên – Huế, mơ hình ni sinh khối VKL trong bể lớn được tiến hành theo sơ đồ dưới đây:
+ Bể ni: Bể xây có tổng diện tích bề mặt 20m2 (Dài 10m; rộng lọt lịng 2m - khơng tính vách ngăn giữa; cao 0.5m) bo trịn 4 góc, ở giữa có 1 bức tường ngăn hụt tạo dịng chảy lưu thơng khi khuấy sục. Hệ khuấy bằng guồng (bao gồm guồng và mô tơ).
+ Hệ thống phụ trợ: 02 tank inoxidable (2x3m3) chứa nước khống và dùng cho vệ sinh định kì bể nuôi tảo; 05 thùng nhựa loại 200L dùng cho nhân giống và pha hóa chất; 01 bàn đá để pha hóa chất và dùng cho các thao tác có liên quan.
+ Toàn bộ hệ thống được che mưa bởi lớp chất dẻo màu trắng (nilông Israel hoặc lớp nhựa) gắn trên khung nhơm chịu lực có diện tích khoảng 75m2 (rộng 5m, dài 15m).
Hình 3.4. Bể ni sinh khối tảo tại Mỹ An, Thừa Thiên Huế.
Vệ sinh tồn bộ hệ thống bể ni bằng chlorine 30 - 50ppm, rửa sạch lại bằng nước ngọt nhiều lần, sau đó phơi khơ bể ni, tráng lại tồn bộ hệ thống bể bằng nước khoáng đã xử lý trước khi tiến hành nuôi sinh khối.
b. Phương pháp lựa chọn tảo giống
Việc chọn chủng tảo giống để ni sinh khối có tầm quan trọng đặc biệt và trước tiên phải dựa trên năng suất tối đa, chất lượng sinh khối tốt. Tiến hành chọn tảo giống để nuôi tại khu nuôi thu sinh khối bằng cách so sánh tốc độ sinh trưởng của các chủng tảo ở các cơng thức thí nghiệm và chọn ra chủng phát triển tốt nhất trong mơi trường bổ sung nước khống khi đo mật độ tế bào tại bước sóng 445nm trên máy quang phổ.
- Nghiên cứu này được tiến hành trong phòng thí nghiệm. - Thí nghiệm được bố trí với các cơng thức như sau:
Bảng 4.3. Cơng thức thí nghiệm lựa chọn tảo giống
Chủng tảo Môi trường nuôi
SP2 ĐC MT Zarrouk pha bằng nước cất TN MT Zarrouk pha bằng nước khoáng
SP4 ĐC MT Zarrouk pha bằng nước cất TN MT Zarrouk pha bằng nước khoáng
SP8 ĐC MT Zarrouk pha bằng nước cất TN MT Zarrouk pha bằng nước khoáng
T38 ĐC MT Zarrouk pha bằng nước cất TN MT Zarrouk pha bằng nước khoáng
T48 ĐC MT Zarrouk pha bằng nước cất TN MT Zarrouk pha bằng nước khoáng
- Mỗi cơng thức thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
- Tất cả các cơng thức thí nghiệm đều được bố trí trong phịng thí nghiệm với cùng điều kiện môi trường như nhau (Nhiệt độ 25 – 30oC, ban đầu pH = 9, có chiếu sáng thích hợp 2000 – 3000lux, chu kỳ sáng tối là 12:12). Theo dõi tốc độ tăng trưởng của tảo 3 ngày 1 lần.
Hình 3.5. Bố trí thí nghiệm lựa chọn tảo giống
c. Phương pháp chuẩn bị tảo giống
Sau bước chọn giống để sản xuất, tảo được đưa vào nhân sinh khối để nồng độ bể nuôi đạt OD = 0.3; sử dụng nước khống để pha mơi trường; kiểm tra các điều kiện ánh sáng để tránh việc tảo bị sốc khi triển khai nhân giống ban đầu.
Hình 3.6. Quy trình nhân giống tảo phục vụ ni sinh khối
Hình 3.7. Ni tảo giống trước khi cho vào bể
3.3.4. Nuôi và thu sinh khối tảo
3.3.4.1. Tiến hành nuôi tảo
+ Cấp nước khoáng: Nước được bơm từ tank chứa nước khoáng đã chuẩn bị vào bể nuôi đến chiều cao mực nước khoảng 30 – 40cm.
+ Bổ sung dinh dưỡng: Bổ sung mơi trường dinh dưỡng thích hợp (Mơi trường Zarrouk cải tiến với các hàm lượng chất dinh dưỡng thêm vào nước khống được tính tốn nêu ở mục 3.2.3). Lượng hóa chất được tính tốn cho tồn bộ thể tích ni cấy và hịa tan từng loại trước khi cho vào bể nuôi. Bật mơ tơ cho guồng quạt nước hoạt động, hóa chất phải đảm bảo được tan hết và hòa đều trong nước khống. Mơi trường ni nên để ổn định trong vài giờ trước khi tiếp tảo giống vào bể.
+ Cấp tảo giống: Khi đã chuẩn bị xong môi trường dinh dưỡng, cho tảo giống vào nuôi. Lượng tảo giống cấp vào hệ thống nuôi sinh khối sao cho mật độ quang ban đầu dao động khoảng OD445nm = 0.3.
pH, nhiệt độ, cường độ ánh sáng để có những biện pháp xử lý kịp thời khi có những biến động lớn về các yếu tố môi trường. Trong trường hợp nắng quá gay gắt, nhiệt độ trên 38oC tảo sẽ bị chết. Vì vậy có thể giảm bớt cường độ ánh sáng, hạ nhiệt cho hệ thống nuôi sinh khối bằng cách che phía trên bể nuôi lớp nilon màu để làm giảm ánh nắng chiếu trực tiếp vào buổi trưa. Luôn đảm bảo vệ sinh khu vực nuôi sạch sẽ, hạn chế các nguồn lây nhiễm vào bể nuôi. Kiểm tra độ thuần chủng và sự phát triển tảo thường xuyên bằng cách quan sát qua kính hiển vi, theo dõi mật độ tảo thông qua đo mật độ quang (OD445nm) 3 ngày/lần để xác định đúng thời điểm thu hoạch cho tảo năng suất cao và chất lượng tốt. Hàng ngày đo lượng nước bị hao hụt để cấp bổ sung lượng nước bị mất do bay hơi và trong mỗi lần thu hoạch.
=> Trong quá trình này, theo dõi một số thơng số:
+ Đánh giá tốc độ sinh trưởng của tảo qua các lần nuôi thu sinh khối. + Sự thay đổi của một số yếu tố môi trường nuôi sinh khối tảo tại Mỹ An, Thừa Thiên Huế như: nhiệt độ tại khu nuôi sinh khối; pH, nồng độ một số thành phần có trong mơi trường dinh dưỡng ([HCO3-], [CO32-],[P_PO43-], [N_NO3-]).
3.3.4.2. Thu hoạch tảo
Khi kiểm tra thấy OD = 1.2 - 1.4, tiến hành thu tảo đến OD = 0.5
Hình 3.9. Thu sinh khối tảo bằng lưới lọc.
+ Phương pháp thu hoạch: dùng lưới lọc chuyên dụng. Sinh khối tảo sệt được thu phía trên lưới, phần nước phía dưới lưới được cho chảy lại vào bể nuôi.
+ Sấy sinh khối và bảo quản sản phẩm: Sau khi tách tảo khỏi môi trường và cô đặc sơ bộ, tiến hành sấy phun ngay để giữ sinh khối khỏi bị vi sinh vật huỷ hoại. Sau khi sấy, tảo được đóng gói và cất giữ ở điều kiện khô và mát.
3.3.4.3. Phương pháp xác định một số yếu tố trong môi trường nuôi sinh khối tảo
* Phương pháp xác định tốc độ sinh trưởng của tảo bằng phương pháp đo mật độ quang học (OD) tại bước sóng 445 nm
Mật độ tế bào tảo Spirulina platensis trong môi trường được xác định gián tiếp nhờ phương pháp đo mật độ hấp thụ quang của các sắc tố Chlorophyll trong tế bào. Các sắc tố này hấp thụ chủ yếu 2 bước sóng trong ánh sáng mặt trời tương ứng là 420nm và 665nm (Đặng Đình Kim và Đặng Hồng Phước
Hiền, 1999). Nói một cách khác là trong điều kiện sinh trưởng nhất định thì OD tỷ lệ thuận với mật độ tế bào. Đối với tảo Spirulina platensis, tiến hành đo mật độ tảo bằng máy quang phổ UV-2450 Shimatzu (Nhật Bản) ở bước sóng 445nm (OD445nm). Theo phương pháp này, số lượng photon ánh sáng hấp thụ tỷ lệ thuận với sinh khối tế bào trong mẫu đem đo (khi mẫu có nồng độ tế bào đậm đặc quá như OD > 1.5 thì cần pha lỗng với dịch tảo).
* Đo nhiệt độ tại nơi nuôi sinh khối: Đo bằng nhiệt kế thủy tinh, tiến hành đo hàng ngày; mỗi ngày 4 lần vào 6 - 7h, 11 - 12h, 14 - 15h và 17 - 18h.
* Phương pháp đo pH môi trường nuôi: Đo bằng máy pH meter, tiến hành đo 3 ngày 1 lần.
* Xác định hàm lượng HCO3-, CO32-: Bằng phương pháp chuẩn độ axit 0.1N HCl
Độ kiềm trong nước gây ra do sự có mặt của các anion axit yếu mà chủ yếu là các ion OH-, CO32-, HCO3-. Khi pH của nước lớn hơn 8,2 thì độ kiềm của nước do cả ba loại ion trên gây ra. Khi pH của nước nhỏ hơn 8,2 thì khơng tồn tại hai loại ion OH- và CO32-, độ kiềm do ion HCO3- gây ra.
- Hóa chất sử dụng: HCl, Metyl da cam, Phenolphtalein đươc pha chế như sau: Dung dịch HCl 0.1 N: Pha HCl trong ống chuẩn 0.1N thành 1L với nước cất. Dung dịch chỉ thị Phenolphtalein: hòa tan 0.1g Phenolphtalein vào 100ml cồn. Dung dịch chỉ thị metyl da cam: hòa 0.1 g metyl da cam vào 100ml nước cất. - Cách tiến hành:
+ Xác định CO32-: Lấy 10ml mẫu, thêm 1 giọt phenolphtalein, nếu xuất
hiện màu hồng thì có kiềm tự do. Chuẩn độ với HCl 0.1 N tới khi hết màu. Ghi nhận thể tích HCl đã chuẩn (V1).
X1 (g/L) = V1*N*60*1000 V
+ Xác định HCO3-: Lấy 10ml mẫu, thêm 1 giọt metyl da cam. Chuẩn độ với
HCl 0.1N tới khi dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu gạch non. Ghi nhận thể tích HCl đã chuẩn (V2).
X2 (g/L) = (V1-V2)*N*61*1000 V
Trong đó:
Với X1, X2 lần lượt là nồng độ của CO32- và HCO3-
V1 là thể tích của HCl 0.1N chuẩn độ với Phenolphtalein (ml) V2 là thể tích của HCl 0.1N chuẩn độ với Metyl da cam (ml) V là thể tích mẫu lấy để chuẩn (ml)
N là nồng độ HCl pha để chuẩn 60 là đương lượng gam của CO32- 61 là đương lượng gam của HCO3- 1000 để quy đổi về 1L.
* Xác định hàm lượng P_PO43- (Standard methods, 1998): Sử dụng phương pháp Acid ascorbic.
* Xác định hàm lượng N_NO3- (Standard methods, 1998): Sử dụng phương pháp Salycilate.
* Xác định tốc độ sinh trưởng đặc trưng của tảo (Lê Thị Bích Ngọc, 2010) Tính theo cơng thức:
SGR: Tốc độ tăng trưởng đặc trưng của tảo ODo: Mật độ quang học ban đầu
ODt: Mật độ quang học cực đại t: Thời gian tảo đạt mật độ cực đại
* Phương pháp xác định trọng lượng khô của sinh khối (Richmond et al., 1986):
- Nguyên tắc: Dựa vào sự bay hơi nước do nhiệt để tính độ chênh lệch khối lượng trước và sau khi sấy.
- Cách tiến hành:
+ Sấy giấy lọc ở nhiệt độ 70oC qua đêm, để nguội và đem cân, ghi lại trọng lượng G1.
+ Rửa phần trên giấy lọc bằng HCl (pha loãng 1:1 với nước cất. Khi dùng, lấy 0,5ml dung dịch này pha thành 100ml bằng nước cất) sử dụng để loại khoáng lẫn trong sinh khối.
+ Giấy lọc cùng với sinh khối trên giấy lọc được sấy ở 70oC để qua đêm. Làm nguội trong bình hút ẩm và đem cân, ghi lại trọng lượng G2.
- Tính kết quả: Trọng lượng khơ (DW) được xác định theo cơng thức:
Trong đó:
10 là thể tích dịch ni (ml)
1000 là số chuyển đổi từ ml sang lít
G2: trọng lượng giấy lọc và sinh khối đã sấy (g) G1: trọng lượng giấy lọc đã sấy (g).
3.3.5. Đánh giá chất lượng tảo nuôi thu sinh khối trong nguồn nước khoáng ở Mỹ An, Thừa Thiên Huế
Sinh khối tảo thu hoạch được trộn lẫn với nhau. Lấy một phần lượng sinh khối khô đem gửi mẫu phân tích các thành phần hóa học có trong tảo, phần cịn lại được đóng hộp kín và bảo quản ở nơi khơ thống.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. CHẤT LƯỢNG NƯỚC KHOÁNG MỸ AN 4.1. CHẤT LƯỢNG NƯỚC KHOÁNG MỸ AN
Kết quả phân tích thành phần hóa lý của nước khoáng Mỹ An ở xã Phú Dương, huyện Phú Vang, tỉnh Thừa Thiên – Huế được thể hiện ở bảng 4.1
Bảng 4.1. Thành phần hóa học của nước khống.
STT Chỉ tiêu phân tích Kết quả
(mg/l) STT Chỉ tiêu phân tích
Kết quả (mg/l)
1 pH 7.78 14 Sunfat (SO42-) 2.577
2 Độ cứng (tính theo CaCO3) 328.0 15 Nitrat (NO3-) < 0.02
3 SiO2 25.058 16 Nitrit (NO2-) < 0.02
4 Sunfua (S2-) 0.48 17 HCO3- 1055.30
5 Amoni (NH4+) 0.05 18 Florua (F-) 0.887
6 Natri (Na) 134.79 19 Asen (As) 0.00370
7 Kali (K) 58.67 20 Cadimi (Cd) 0.00019
8 Canxi (Ca) 94.40 21 Chì (Pb) 0.00121
9 Magie (Mg) 22.08 22 Thủy ngân (Hg) 0.00010
10 Sắt II (Fe2+) < 0.05 23 Đồng (Cu) 0.00374
11 Sắt III (Fe3+) < 0.02 24 Kẽm (Zn) 0.061
12 Nhôm (Al) < 0.02 25 Photphat (PO43-) 0.086
13 Clorua (Cl-) 1251.38
Từ bảng 4.1 ta thấy hàm lượng HCO3- (1055.30 mg/l) khá cao, vì vậy nguồn nước khống Mỹ An có thể sử dụng nuôi tảo Spirulina platensis tốt.
HCO3- cung cấp cacbon cho tảo, đây được xem là một trong các nguồn dinh dưỡng chính của tảo Spirulina (Jorge, A.V.C., 2002). Kết quả nghiên cứu nuôi
tảo Spirulina của Vonshak (1997) cho biết sau chi phí lao động, yếu tố quyết
định giá thành của sản phẩm tảo Spirulina là chi phí dinh dưỡng, đặc biệt là chi phí của nguồn cacbon. HCO3- đóng vai trị quan trọng trong việc duy trì ổn định hệ đệm CO2 - H2CO3 - HCO3-, thơng qua đó duy trì ổn định pH ở ngưỡng thích hợp cho ni sinh khối tảo và hạn chế nhiễm tạp. HCO3- cung cấp CO2 cho quá
trình quang hợp của tảo. Nguồn CO2 trong khơng khí khơng thể đáp ứng nhu cầu cacbon của cho các loài tảo quang tự dưỡng như các các lồi cây trên cạn vì thế việc cung cấp CO2 và HCO3- là rất quan trọng cho các hệ thống nuôi sinh khối tảo năng suất cao. Sự có sẵn HCO3- trong nước tạo điều kiện cho tảo sinh trưởng và phát triển tốt đồng thời giảm chi phí cung cấp CO2 hay HCO3-.
Hàm lượng Na+ cũng khá cao (134.79 mg/l). Từ lâu Na+ được biết là rất cần thiết cho sự sinh trưởng của tảo lam (Apte, 1980). Sự cần thiết này thể hiện ở nhu cầu Na+ cho quá trình quang hợp. Hai hoạt động chính của Na+ đã được xác định là tham gia vận chuyển HCO3- (Espie, 1987) và vận chuyển CO2. Theo Joshep (1984) Na+ có vai trị quan trọng trong việc trao đổi chất của tảo, không thể được thay thế bởi các ion khác như K+, Li+, Ca2+, Pb+, Cs+ hoặc Mg2+. Sự hiện diện của Na+ sẽ tăng cường việc cố định O2 và CO2. Sự thiếu hụt Na+ sẽ làm giảm hấp thụ phosphate dẫn đến thiếu ATP, kìm hãm quá trình cố định đạm. Tuy nhiên quá nhiều Na+ có thể gây độc cho tảo.
Hàm lượng K+ trong nước khoáng Mỹ An là 58.67 mg/l. Ion K+ rất cần thiết cho sự sinh trưởng của tảo, trong điều kiện thiếu K+, sinh trưởng và quang hợp của tảo bị giảm, hô hấp tăng (Becker, 1994). Tỉ lệ K+/Na+ của nước khoáng là 0.44 (nhỏ hơn 5), nằm trong giới hạn cho phép sử dụng nguồn nước để nuôi trồng tảo Spirulina platensis. Theo Nguyễn Hữu Thước (1988), tỉ lệ K+/Na+ lớn hơn 5 sẽ làm chậm sinh trưởng của tảo, khi tỷ lệ đó quá cao sẽ phá vỡ cấu trúc tế bào của tảo.
Hàm lượng Ca2+ trong nước khống Mỹ An khơng q cao (94.4 mg/l). Vai trò sinh lý của Ca2+ trong nuôi tảo vẫn chưa được hiểu rõ tuy nhiên Ca2+ được chứng minh là cần thiết cho sự phát triển của tảo. Theo Becker (1994), Ca2+có lẽ đóng vai trị duy trì màng tế bào chất, hình thành bộ khung hoặc thành tế bào tảo. Tuy nhiên nhu cầu Ca2+ cần cho tảo rất thấp, nếu hàm lượng này quá cao sẽ làm giảm tác dụng của HCO3- cung cấp vào cho phản ứng tạo kết tủa. Hàm lượng các kim loại nặng Cd (0.00019mg/l), Pb (0.00121mg/l), Hg (0.00010mg/l), As (0.00370mg/l) là rất thấp, hàm lượng này nhỏ hơn nhiều so