3.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng tích luỹ kẽm cao − Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng tích lũy kẽm cao từ 96 chủng nấm men thuộc Saccharomyces được tiếp nhận từ trung tâm Vi sinh vật công nghiệp – Viện Công nghiệp thực phẩm. Môi trường lên men YM có bổ sung muối vô cơ Zn(NO3)2 với nồng độ 1g/l, tỷ lệ tiếp giống 10%. Quá trình lên men thu sinh khối được thực hiện trong bình tam giác 250ml với thể tích môi trường
lên men là 100ml. Điều kiện cho quá trình lên men được tiến hành trong máy lắc 150 vòng/phút, ở điều kiện nhiệt độ 28°C trong 72 giờ.
Chỉ tiêu theo dõi: nồng độ Zn2+ được tích lũy trong tế bào nấm men, sinh khối nấm men.
Thí nghiệm 2: Lựa chọn, xác định nồng độ và thời điểm bổ sung muối kẽm.
− Để lựa chọn nguồn kẽm phù hợp cho việc tạo sinh khối nấm men giàu kẽm, các loại muối kẽm được khảo sát là: Zn(NO3)2, ZnSO4, ZnCl2. Với các dải nồng độ: 0; 0,25; 0,5; 0,75; 1; 2g/l được bổ sung vào môi trường lên men có chứa: 3g/l cao nấm men, 3g/l dịch chiết malt, 5g/l bacto pepton, 10g/l glucose với tỷ lệ tiếp giống là 10%. Thí nghiệm được tiến hành trong môi trường có pH được hiệu chỉnh về 6,0 bằng dung dịch HCl0,1M. Quá trình lên men được tiến hành ở 28°C trong 72 giờ, chế độ lắc 150 vòng/phút.
− Sau khi đã lựa chọn được nồng độ và nguồn muối kẽm phù hợp tiến hành lên men bổ sung muối kẽm tại các thời điểm 0, 9, 18, 27 giờ để xác định điều kiện phù hợp nhất.
Chỉ tiêu theo dõi: nồng độ Zn2+ được tích lũy trong tế bào nấm men, sinh khối nấm men.
Thí nghiệm 3: Lựa chọn nguồn dinh dưỡng, thành phần môi trường lên men.
- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng tới quá trình tích lũy kẽm. + Lựa nguồn cacbon cho quá trình tạo sinh khối nấm men giàu kẽm được thực hiện trên môi trường cơ bản có chứa: 3g/l cao nấm men, 3g/l dịch chiết malt, 5g/l bacto pepton, 1g/l ZnSO4 với 10% tỷ lệ tiếp giống, có bổ sung thêm 10g/l với một trong các nguồn cacbon cần khảo sát chọn lựa sau: Glucose, galactose, frutose, lactose, maltose, sucrose. Sau khi đã lựa chọn được nguồn cacbon phù hợp, tiến hành khảo sát nồng độ cacbon ở 10, 50, 100, 150g/l để xác định được nồng độ thích hợp cho quá trình tích lũy kẽm. Quá trình lên men được tiến hành ở 28°C trong 72 giờ, chế độ lắc 150vòng/phút.
Chỉ tiêu theo dõi: nồng độ Zn2+ được tích lũy trong tế bào nấm men, sinh khối nấm men.
+ Nguồn nitơ bao gồm: cao nấm men, tripton, pepton, cao thịt bò, casein, 10g/l mỗi loại được bổ sung vào môi trường cơ bản có chứa: 3g/l dịch chiết malt,
10g/l glucose, 1g/l ZnSO4 với tỷ lệ tiếp giống 10%. Khảo sát ảnh hưởng bởi các nguồn nitơ tới quá trình tích lũy kẽm. Tiếp tục thí nghiệm khảo sát nồng độ nitơ thích hợp với các mức 5; 10; 15; 20g/l để xác định nồng độ phù hợp. Quá trình lên men được tiến hành ở 28°C trong 72 giờ, chế độ lắc 150vòng/phút.
Chỉ tiêu theo dõi: nồng độ Zn2+ được tích lũy trong tế bào nấm men, sinh khối nấm men.
- Nghiên cứu lựa chọn ion kim loại bổ sung
Để lựa chọn ion kim loại phù hợp cho việc tạo sinh khối nấm men các loại ion kim loại được khảo sát là MgSO4 với nồng độ: 0; 0,5; 1,5 g/l; KH2PO4 với nồng độ: 0; 1; 2; 3; 4; 5 g/l và Fe2(SO4)3 với nồng độ 0; 0,5; 1; 2 g/l được bổ sung vào môi trường YM để tiến hành lên men có 1g/l kẽm ZnSO4 và tỷ lệ tiếp giống 10%. Quá trình lên men được tiến hành ở 28°C trong 72 giờ, chế độ lắc 150vòng/phút.
Chỉ tiêu theo dõi: nồng độ Zn2+ được tích lũy trong tế bào nấm men, sinh khối nấm men.
Thí nghiệm 4: Lựa chọn điều kiện cho quá trình lên men.
Khảo sát điều kiện pH, nhiệt độ, chế độ lắc tới quá trình tích lũy kẽm Sử dụng môi trường YM có bổ sung 1 g/l ZnSO4 trong nghiên cứu. Thí nghiệm được tiến hành trên bình tam giác 250ml trong đó có chứa 100ml dung dịch môi trường lên men. pH của dịch môi trường trước lên men được khảo sát tại các giá trị: từ 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7 hiệu chỉnh bằng dung dịch H2SO4 0,1M hoặc NaOH 0,1M. Các mức nhiệt độ được khảo sát là: 25, 28, 30, 35 oC. Các chế độ lắc được khảo sát là 0, 50, 100, 150, 200 vòng/phút để tìm ra điều kiện thích hợp nhất.
Chỉ tiêu theo dõi: nồng độ Zn2+ được tích lũy trong tế bào nấm men, sinh khối nấm men.
Thí nghiệm 5: Tối ưu hoá điều kiện lên men thu sinh khối nấm men giàu kẽm
Sau khi nghiên cứu lựa chọn nguồn dinh dưỡng, thành phần môi trường, điều kiện lên men phù hợp tiến hành thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy với 3 yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất. Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp leo dốc ứng với 3 yếu tố ảnh hưởng được khảo sát: x1, x2, x3. Hàm mục tiêu (y) là hàm lượng kẽm trong sinh khối. Phương trình hồi quy có dạng:
y = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3 + b12x1x2 + b13x1x3 + b23x2x3 + b123x1x2x3 Với: b0, b1, b2, b3, b12, b13, b23 là các hệ số của phương trình hồi quy. Việc thiết kế thí nghiệm và xử lí số liệu cho quá trình tối ưu hóa tạo sinh khối nấm men giàu kẽm được thực hiện bằng phần mềm JMP 10.0.
3.3.2. Phương pháp phân tích
− Phương pháp xử lý mẫu sinh khối nấm men giầu kẽm: Sinh khối nấm men thu được mang đi rửa với nước khử ion với tỉ lệ 1:5, rửa 3 lần. Sử dụng máy li tâm với tốc độ 6000 vòng/ phút trong thời gian 20 phút để thu sinh khối sau khi rửa. Tiến hành làm khô sinh khối nấm men ở 60oC trong 2h, sau đó kết thúc quá trình sấy ở 105oC đến khối lượng không đổi.
− Phương pháp phân tích AAS: Hàm lượng kẽm tổng số trong tế bào nấm men được xác định bằng quang phổ hấp phụ nguyên tử (AAS). Cân 50 mg mẫu nấm men khô chuyển vào bình phá mẫu, thêm vào 2 ml HNO3 đặc và ngâm qua đêm, thêm 1 ml H2O2 đặc và tiến hành phá mẫu bằng lò vi sóng. Mẫu sau khi để nguội được định mức thành 10 ml, lấy 1 ml pha loãng thành 10 ml bằng dung dịch HNO3 2%. Mẫu sau khi xử lí được đưa vào hệ thống máy đo quang phổ hấp phụ nguyên tử và tiến hành phân tích hàm lượng kẽm ở bước sóng 213,9 nm (Shet et al., 2011).
3.3.3. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý trên Excel, minitab 16, thuật toán thống kê student T’test, F’test và phương pháp phân tích phương sai một nhân tố ngẫu nhiên (one way ANOVA). Nếu p < 0.05 được coi là sai khác có ý nghĩa, nếu p > 0,05 sự sai khác là không có ý nghĩ thống kê. Xử lí số liệu cho quá trình tối ưu hóa tạo sinh khối nấm men giàu kẽm được thực hiện bằng phần mềm JMP 10.0.
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1. KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MEN CÓ KHẢ NĂNG TÍCH LŨY KẼM CAO TÍCH LŨY KẼM CAO
Từ 96 chủng nấm men thuộc Saccharomyces được tiếp nhận từ trung tâm Vi sinh vật công nghiệp – Viện Công nghiệp thực phẩm. Môi trường lên men YM có bổ sung muối vô cơ Zn(NO3)2 với nồng độ 1g/l. Quá trình lên men thu sinh khối được thực hiện trong bình tam giác 250ml với thể tích môi trường lên men là 100ml, pH của môi trường được điều chỉnh tới 4,5 bằng HCl 0,1M. Điều kiện cho quá trình lên men được tiến hành trong máy lắc 150 vòng/phút, ở điều kiện nhiệt độ 28°C trong 72 giờ.
Kết thúc quá trình sàng lọc cho thấy, khả năng tích luỹ kẽm ở tất cả các chủng là rất khác nhau. Trong đó chủng thể hiện khả năng tích luỹ kẽm cao nhất là chủng S.cerevisiae CNTP 4087 với mức kẽm là 8,91 mg/g sinh khối khô, còn chủng thấp nhất là S.cerevisiae CNTP 4100 ở mức kẽm tích luỹ là 0,56 mg/g. Kết quả chi tiết về hàm lượng kẽm trong sinh khối và lượng sinh khối tích luỹ của các chủng được thể hiện tại Phụ lục.
Hình 4.1. Khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối của các chủng nấm men được sàng lọc
Kết quả cho thấy, trong tổng số 96 chủng nấm men được nghiên cứu có 39 chủng thể hiện khả năng tích kẽm thấp, dưới 1 mg/g sinh khối khô chiếm tỷ lệ 40,62%; 42 chủng tích kẽm trong khoảng từ 1-3 mg/g sinh khối chiếm tỷ lệ
40,62%
43,75%
15,63 %
Chủng có hàm lượng kẽm trong sinh khối <1 mg/g Chủng có hàm lượng kẽm trong sinh khối 1-3 mg/g Chủng có hàm lượng kẽm trong sinh khối >3 mg/g
43,75% và 15 chủng có khả năng tích lũy kẽm với hàm lượng trên 3 mg/g sinh khối, chiếm tỷ lệ 15,63% được thể hiện qua bảng dưới đây:
Bảng 4.1. Khả năng sinh trưởng và hàm lượng kẽm trong sinh khối của 15 chủng có khả năng tích lũy kẽm cao
STT Chủng S.cerevisiae Khối lượng sinh khối khô (g/100ml)
Hàm lượng kẽm trong sinh khối khô (mg/g)
1 CNTP 4001 0,91 4,23 2 CNTP 4007 0,93 7,50 3 CNTP 4017 0,90 5,23 4 CNTP 4059 0,89 7,05 5 CNTP 4057 0,82 3,12 6 CNTP 4080 0,95 7,65 7 CNTP 4054 0,87 3,23 8 CNTP 4123 0,79 4,19 9 CNTP 4070 0,98 3,85 10 CNTP 4087 0,94 8,91 11 CNTP 4088 0,91 3,50 12 CNTP 4130 0,87 5,47 13 CNTP 4131 0,95 5,89 14 CNTP 4157 0,89 7,19 15 CNTP 4158 0,91 6,35
Kết quả trên cho thấy, sau khi được bổ sung nồng độ muối kẽm ở nồng độ 1 g/l vào môi trường cơ bản thì hàm lượng muối kẽm thu được trong sinh khối khô nấm men tăng mạnh, điển hình là lên tới 8,91mg/g ở chủng S.cerevisiae
CNTP 4087. Điều này kiểm chứng thêm một lần nữa về khả năng tích lũy các nguyên tố vi lượng trong đó có kẽm của S.cerevisiae. Chính vì vậy chủng nấm
men S.cerevisiae CNTP 4087 được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.2. KẾT QUẢ ẢNH HƯỞNG NGUỒN MUỐI KẼM KHÁC NHAU ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN THU NHẬN SINH KHỐI NẤM MEN GIÀU KẼM QUÁ TRÌNH LÊN MEN THU NHẬN SINH KHỐI NẤM MEN GIÀU KẼM
kẽm, các loại muối kẽm được khảo sát là: Zn(NO3)2, ZnSO4, ZnCl2, 3 loại muối kẽm này là các muối thường được sử dụng cho các nghiên cứu tích lũy kẽm trong tế bào nấm men. Với các dải nồng độ: 0,25; 0,5; 0,75; 1; 2g/l được bổ sung vào môi trường lên men có chứa: 3g/l cao nấm men, 3g/l dịch chiết malt, 5g/l bacto pepton, 10g/l glucose. Thí nghiệm được tiến hành trong môi trường có pH được hiệu chỉnh về 6,0 bằng dung dịch HCl 0,1M. Quá trình lên men được tiến hành ở 28°C trong 72 giờ, chế độ lắc 150vòng/phút.
Sau khi đã lựa chọn được nồng độ và nguồn muối kẽm phù hợp tiến hành lên men bổ sung muối kẽm tại các thời điểm 0, 9, 18, 27 giờ để xác định điều kiện phù hợp nhất.
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của các loại muối kẽm tới khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm tích lũy
Nồng độ muối kẽm (g/l)
Khối lượng sinh khối khô (g/100ml)
Hàm lượng kẽm trong sinh khối khô (mg/g) Zn(NO3)2 ZnSO4 ZnCl2 Zn(NO3)2 ZnSO4 ZnCl2
0 0,88aA 0,89aA 0,89aA 0,34aF 0,34aF 0,34aF 0,25 0,87aA 0,89aA 0,69bB 2,08bE 2,48aE 2,45aE 0,5 0,86aA 0,87aA 0,60bC 4,71bD 5,98aD 5,94aD 0,75 0,85aA 0,86aA 0,55bC 5,29cC 6,85aC 6,53bC 1 0,65aB 0,65aB 0,34bD 8,87bB 9,15aB 8,93bB 2 0,07aC 0,08aC 0,02bE 10,03cA 11,96aA 10,31bA
(*) A, B, C, D là các giá trị thể hiện khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm trong sinh khối khô theo các nồng độ muối kẽm.
a, b, c, d là các giá trị thể hiện khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm trong sinh khối khô theo các loại muối kẽm ở cùng nồng độ.
Các chữ cái khác nhau là khác nhau về ý nghĩ thống kê với α = 0,05
Qua bảng 4.2 kết quả về hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối nấm men trên 3 loại muối kẽm nitorat, kẽm sunphat và kẽm clorua hoàn toàn có sự sai khác, mức sai khác này là có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Kết quả này cho thấy, khả năng chuyển hóa nguồn muối kẽm tích lũy kẽm trong tế bào nấm men
S.cerevisiae CNTP 4087 với mỗi loại muối kẽm khác nhau là khác nhau. Việc sử
dụng muối kẽm sunphat và kẽm clorua cho khả năng tích lũy kẽm cao hơn muối kẽm nitorat. Hơn nữa, xét về khối lượng sinh khối khô thu được thì kẽm sunphat
thu được khối lượng sinh khối khô sau lên men cao hơn hai muối còn lại ở tất cả các nồng độ nghiên cứu. Chính vì vậy, muối kẽm sunphat được lựa chọn làm nguồn muối bổ sung cho các nghiên cứu tiếp sau.
Có thể nhận thấy, nồng độ muối kẽm bổ sung vào môi trường nuôi cấy có mối liên quan chặt chẽ với hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối. Nồng độ muối kẽm bổ sung càng cao thì hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối càng lớn. Tuy nhiên, tác dụng độc hại của kim loại này lên sinh trưởng và phát triển của tế bào lại rất rõ rệt khi tăng dần nồng độ muối kẽm. Điển hình là khi bổ sung ở nồng độ 0,25 g/l kẽm sunphat khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối chỉ đạt 2,48 mg/g, nồng độ này chưa ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của nấm men. Khi nồng độ bổ sung muối kẽm sunphat lên tới 1 và 2 g/l thì hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối có sự gia tăng mạnh tới 9,15 mg/g và 11,96 mg/g nhưng ở nồng độ 2g/l thì nấm men bị ức chế sinh trưởng hoàn toàn. Chính vì vậy, với mục tiêu thu nhận được lượng lớn sinh khối nấm men giàu kẽm thì chỉ nên lựa chọn nồng độ muối kẽm 1g/l ZnSO4 cho quá trình lên men.
Sau khi đã lựa chọn được nguồn muối kẽm phù hợp, thí nghiệm được tiếp tục tiến hành và khảo sát thời điểm bổ sung muối kẽm sao cho lượng kẽm tích lũy trong sinh khối khô đạt hiệu quả cao nhất. Theo đó, chủng nấm men được tiến hành lên men trong môi trường YM có bổ sung kẽm sunphat nồng độ 0,5 g/l tại các thời điểm 0, 9, 18 và 27 giờ. Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần, các kết quả cụ thể được trình bày ở hình 4.2.
Hình 4.2. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung muối kẽm tới khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm tích lũy
0.78 0.86 0.88 0.89 8.92 8.89 4.53 2.26 0 2 4 6 8 10 0.75 0.77 0.79 0.81 0.83 0.85 0.87 0.89 0 9 18 27 hàm lư ợ ng k ẽm t ro ng s in h kh ối k hô (m g/ g) K h ối lư ợn g si n h k hố i k hô (g /1 00 m l) Thời gian (h)
Kết quả ở hình 4.2 cho thấy, thời điểm bổ sung muối kẽm sunphat có ảnh hưởng rất lớn tới hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối nấm men. Đồng thời, thời điểm bổ sung kẽm sau 9 giờ của quá trình lên men thì hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối giảm dần. Cụ thể, hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối tại thời điểm 0 và 9 giờ của quá trình lên men dao động trong khoảng 8,92 - 8,89 mg/g nhưng tại thời điểm 18 và 27 giờ giá trị này giảm dần chỉ còn 4,53 và 2,26 mg/g sinh khối. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả của nhóm nghiên cứu Roepcke et al. (2011), khi nghiên cứu xác định ảnh hưởng bởi thời điểm bổ sung kẽm đến lượng kẽm tích lũy trong sinh khối nấm men. Đồng thời, các tác giả khác cũng cho rằng quá trình hấp thụ các ion kim loại diễn ra ở pha sớm của