4.3.1. Kết quả lựa chọn nguồn dinh dưỡng
4.3.1.1. Kết quả lựa chọn nguồn cacbon
Lựa nguồn cacbon cho quá trình tạo sinh khối nấm men giàu kẽm được thực hiện trên môi trường cơ bản có chứa: 3g/l cao nấm men, 3g/l dịch chiết malt, 5g/l bacto pepton, 1g/l ZnSO4 có bổ sung thêm 10g/l với một trong các nguồn cacbon cần khảo sát chọn lựa sau: glucose, galactose, frutose, lactose, maltose, sucrose. Kết quả thí nghiệm được thể hiện như sau:
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của các nguồn cacbon tới khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm tích lũy
Nguồn cacbon Khối lượng sinh khối khô (g/100ml) Hàm lượng kẽm trong sinh khối khô (mg/g)
Glucose 0,86A 9,07A Galactose 0,73C 6,58D Frutose 0,80B 7,78C Lactose 0,39D 2,65E Maltose 0,37D 2,31F Sucrose 0,87A 8,44B
(*) A, B, C, D là các giá trị thể hiện khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm trong sinh khối khô theo các nguồn cacbon
Các chữ cái khác nhau là khác nhau về ý nghĩ thống kê với α = 0,05
Từ bảng 4.3 cho thấy, khi sử dụng các nguồn cacbon khác nhau thì khả năng tích lũy kẽm cũng như tốc độ sinh trưởng của nấm men có sự khác biệt rõ rệt. Khả năng tích lũy kẽm vào sinh khối của S. cerevisiae CNTP 4087 giảm dần theo trật tự sau: glucose > sucrose > fructose > galactose>lactose > maltose. Chính vì vậy, nguồn cung cấp cacbon được lựa chọn là đường glucose cho các nghiên cứu tiếp sau. Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Cha khi tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy tạo sinh khối nấm men giàu kẽm trên chủng S. cerevisiae FF10 (Cha et al., 2009). Tiếp đó tiến hành khảo sát ảnh hưởng của glucose tới khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối nấm men ở các nồng độ: 10, 50, 100 và 150g/l. Kết quả được trình bày hình 4.3.
Hình 4.3. Ảnh hưởng bởi nồng độ glucose tới khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm tích lũy 0.59 0.88 0.98 0.98 8.31 7.93 7.87 7.85 7.6 7.7 7.8 7.9 8 8.1 8.2 8.3 8.4 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 10 50 100 150 H àm lư ợn g kẽ m t ro ng s in h kh ối k hô (m g/ g) K h ối lư ợn g si n h kh ối k hô ( g/ 10 0m l) Nồng độ glucose (g/l)
Kết quả ở hình 4.3 cho thấy, tốc độ sinh trưởng và phát triển của nấm men tăng mạnh mẽ khi tăng nồng độ glucose trong môi trường nuôi cấy từ 10g/l tới 100g/l. Điều này thể hiện rõ qua khối lượng sinh khối thu được sau lên men. Khi nồng độ glucose trong môi trường nuôi cấy lên tới 150g/l sự sinh trưởng và phát triển của nấm men sau nuôi cấy có sự thay đổi không đáng kể. Kết quả về hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối nấm men ở các nồng độ glucose bổ sung vào môi trường nuôi cấy cho thấy, khi tăng nồng độ glucose từ 10g/l tới 150g/l đường biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ đường và hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối có chiều hướng giảm dần. Tuy nhiên, sau khi so sánh về mặt thống kê thì sự sai khác giữa các giá trị này là không có ý nghĩa với p > 0,05. Có thể nhận thấy glucose không ảnh hưởng tới khả năng hấp thu kẽm trong sinh khối nhưng lại ảnh hưởng trực tiếp tới sự sinh trưởng và phát triển của nấm men cũng như khối lượng sinh khối sau lên men. Bởi lẽ, glucose là nguồn năng lượng chính cho nấm men đồng hóa và xây dựng cấu trúc tế bào và gia tăng sinh khối. Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, glucose với nồng độ 100g/l là nguồn cacbon phù hợp cho quá trình lên men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm.
4.3.1.2. Kết quả lựa chọn nguồn nitơ
Nguồn nitơ bao gồm: cao nấm men, tripton, pepton, cao thịt bò, casein, 10g/l mỗi loại được bổ sung vào môi trường cơ bản có chứa: 3g/l cao nấm men, 3g/l dịch chiết malt, 5g/l bacto pepton, 10g/l glucose và 1g/l ZnSO4. Khảo sát ảnh hưởng bởi các nguồn nitơ tới quá trình tích lũy kẽm. Tiếp tục thí nghiệm khảo sát nồng độ nitơ thích hợp với các nồng độ: 5; 10; 15; 20g/l nồng độ phù hợp.
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của các nguồn nitơ tới khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm tích lũy
Nguồn nitơ Khối lượng sinh khối khô (g/100ml)
Hàm lượng kẽm trong sinh khối khô (mg/g) Cao nấm men 0,91A 8,65A Tripton 0,86AB 7,97C Pepton 0,84B 8,17B Cao thịt bò 0,87AB 8,10B Casein 0,62C 7,54D
(*) A, B, C, D là các giá trị thể hiện khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm trong sinh khối khô theo các nguồn nitơ
Kết quả ở bảng 4.4 cho thấy có sự khác biệt rõ rệt về hàm lượng kẽm tích lũy và sinh khối thu được khi thay thế các nguồn nitơ khác nhau vào môi trường nuôi cấy. Việc sử dụng nguồn nitro là pepton cũng không làm tăng sinh khối nấm men cũng như hàm lượng kẽm tích luỹ trong sinh khối. Nguồn nitơ là cao nấm men cho thấy cho hàm lượng kẽm tích lũy và khối lượng sinh khối đạt cao nhất nên nguồn nitơ này được lựa chọn là điều kiện thích hợp cho quá trình lên men. Kết quả lựa chọn nguồn nitơ này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Cha, khi tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy tạo sinh khối nấm men giàu kẽm trên chủng
S. cerevisiae FF10 (Cha et al., 2009).
Tiến hành các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nồng độ cao nấm men cao nấm men tới sự tích lũy kẽm trong sinh khối nấm men. Trong nghiên cứu này cao nấm men được bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở các nồng độ: 5, 10, 15, 20g/l. Kết quả được trình bày ở hình 4.4.
Hình 4.4. Ảnh hưởng bởi nồng độ cao nấm men tới khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm tích lũy
Kết quả trên cho thấy, khi tăng nồng độ cao nấm men từ 5g/l lên tới 10g/l chủng S. cerevisiae CNTP 4087 có chiều hướng gia tăng hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối và khối lượng sinh khối sau lên men. Điều đáng chú ý là khi bổ sung nguồn dưỡng chất này ở nồng độ cao lên tới 20g/l lại có tác động không
0.57 0.98 0.96 0.94 8.82 9.29 8.91 8.78 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 5 10 15 20 H àm lư ợn g kẽ m t ro ng s in h k hố i k hô ( m g/ g) K h ối lư ợn g si nh k hố i k h ô (g /1 00 m l) Nồng độ cao nấm men (g/l)
thuận lợi cho quá trình hấp thu kẽm. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Roepcke et al. (2011). Đồng thời, Brady and Ducan (1994) đã chỉ ra rằng cao nấm men có ảnh hưởng tích cực tới sự sinh trưởng, phát triển của nấm men và sự hấp thu kẽm trong sinh khối ở nồng độ thích hợp. Tuy nhiên, ở nồng độ cao chúng có thể liên kết trực tiếp với ion kim loại trong môi trường nuôi cấy gây giảm hấp thu kẽm trong sinh khối nấm men (Brady et al., 1994). Vì thế nguồn nitơ là cao nấm men cao nấm men với nồng độ 10g/l được sử dụng là điều kiện thích hợp cho quá trình lên men.
4.3.2. Kết quả ảnh hưởng của ion kim loại
Qua các nghiên cứu đánh giá tổng quan trong và ngoài nước nhận thấy các kim loại có mối liên hệ tương tác qua lại với nhau và có thể làm thay đổi khả năng tích lũy và độc tính của nó đối với tế bào nấm men. Dựa vào chức năng của kim loại trong tế bào ví dụ như: Mg có khả năng hoạt hóa một vài enzym chuyển hóa glucose thành pyruvate, ATPase màng và hàm lượng các kim loại trong tế bào. Sắt cũng có khả năng làm tăng cường độ hòa tan của kẽm. Đồng thời, tăng cường sự tạo thành phức hợp giữa kẽm và các amino axit như methionin, glycin… có mặt trong môi trường. Nhóm photphat có tác dụng trong việc tạo ra tính hấp thu có chọn lọc cao đối với kẽm (Anderson et al., 1988; Engl et al., 1995). Chính vì vậy, các ion này được tiến hành khảo sát tác động của nó tới quá trình chuyển hóa và tích lũy kẽm trong sinh khối nấm men.
Để lựa chọn ion kim loại phù hợp cho việc tạo sinh khối nấm men các loại ion kim loại được khảo sát là MgSO4 với nồng độ: 0; 0,5; 2,5 g/l; KH2PO4 với nồng độ: 0; 5; 10 g/l và Fe2(SO4)3 với nồng độ 0; 0,1; 1 g/l được bổ sung vào môi trường YM để tiến hành lên men.
Bảng 4.5. Kết quả ảnh hưởng bổ sung khoáng chất tới khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm tích lũy
Ion kim loại (g/l) Khối lượng sinh khối khô (g/100ml)
Hàm lượng kẽm trong sinh khối khô (mg/g)
MgSO4 0 0,88A 8,84B 0.5 0,90A 9,11A 1.5 0,89A 9,14A KH2PO4 0 0,88B 8,90B 1 0,89B 8,91B 2 0,93AB 8,97B 3 0,95A 9,14A 4 0,97A 9,15A 5 0,98A 9,15A Fe2(SO4)3 0 0,88A 8,94B 0.5 0,92B 9,02A 1 0,91B 8,93B 2 0,89B 8,80C
(*) A, B, C, D là các giá trị thể hiện khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm trong sinh khối khô theo các nồng độ ion kim loại.
Các chữ cái khác nhau là khác nhau về ý nghĩ thống kê với α = 0,05
− Kết quả trên cho thấy khi bổ sung magie sunphat ở nồng độ 0,5 g/l hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối nấm men tăng lên từ 8,84 lên đến 9,11 mg/g sinh khối khô. Sự gia tăng này là có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Tiếp đó, khi tăng nồng độ magie sunphat lên tới 1,5 g/l hàm lượng kẽm tích lũy có cao hơn một chút so với nồng độ 0,5 g/l nhưng sau khi so sánh về mặt thống kê thì giá trị này là không có sự sai khác với p > 0,05. Đồng thời, việc bổ sung muối này không ảnh hưởng tới khả năng tích lũy sinh khối của nấm men ở tất cả các nồng độ nghiên cứu. Do vậy, việc bổ sung magie sunphat ở nồng độ 0,5 g/l nhằm tăng khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối nấm men là thông số được lựa chọn để sử dụng cho lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm. Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Roepcke et al. (2011) khi nghiên cứu ảnh hưởng của các ion kim loại tới khả năng tích lũy kẽm trên chủng P.
Guilliermondii (Roepcke et al., 2011). Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng giữa các
ion kim loại có sự tương tác qua lại và có thể làm thay đổi khả năng tích lũy và độc tính của nó đối với tế bào. Dựa vào chức năng của kim loại trong tế bào, Mg có khả năng hoạt hóa một vài enzym chuyển hóa glucose thành pyruvate, ATPase màng và hàm lượng các kim loại trong tế bào.
− Từ bảng 4.5 cho thấy khi bổ sung KH2PO4 ở nồng độ từ 1-2 g/l hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối nấm men không có sự thay đổi rõ rệt. Khi bổ sung 3g/l KH2PO4, hàm lượng kẽm trong sinh khối nấm men tăng lên từ 8,90 lên đến 9,14 mg/g sinh khối khô. Sự sai khác này là có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Giá trị khối lượng sinh khối khô tăng dần khi bổ sung KH2PO4 ở nồng độ tăng dần. Tuy nhiên, sau khi so sánh với nồng độ muối kẽm khi bổ sung 3g/l KH2PO4 thì hàm lượng kẽm cũng như lượng sinh khối thu được không có sự sai khác so với mẫu khi bổ sung KH2PO4 ở nồng độ 4 và 5g/l. Do đó, việc bổ sung KH2PO4 với nồng độ 3g/l có tác dụng tăng hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối nấm men là điều kiện thích hợp cho quá trình lên men thu nhận sinh khối. Ta có thể giải thích vì nhóm photphat có tác dụng trong việc tạo ra tính hấp thu có chọn lọc cao đối với kẽm. Kẽm liên kết với ligand P của phân tử photphat (Engl et al., 1995). Brandy and Ducan (1994) cũng chỉ ra rằng chỉ khi hầu hết các vị trí liên kết của anion bị chiếm đóng thì quá trình tích lũy cation trong
S.cerevisiae mới được bắt đầu. Điều này cũng giải thích cho kết quả nghiên cứu
về khả năng tăng cường hấp thụ kẽm của của muối KH2PO4 trong nghiên cứu của chúng tôi.
− Kết quả trên cho thấy khi bổ sung Fe2(SO4)3 ở nồng độ 0,5 g/l hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối nấm men tăng lên từ 8,94 lên đến 9,02 mg/g sinh khối. Sự sai khác này là có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Khi nồng độ muối Fe2(SO4)3 lên tới 1g/l hàm lượng kẽm tích luỹ trong sinh khối bị ảnh hưởng cũng như sinh khối thu được của chủng S. cerevisiae CNTP 4087 không có sự khác biệt rõ rệt so với nồng độ muối Fe2(SO4)3 là 0,5 g/l. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ Fe2(SO4)3 lên tới 2 g/l lại là điều kiện không thuận lợi cho quá trình tích lũy kẽm trong tế bào. Điều này thể hiện ở hàm lượng kẽm tích lũy tại nồng độ 2 g/l giảm hẳn so với không bổ sung muối sắt. Các giá trị này có sự sai khác về mặt thống kê với p < 0,05. Việc bổ sung muối sắt sunphat không gây ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của nấm men. Khối lượng sinh khối thu được xét trên cả 3 nồng độ bổ sung sắt sunphat đều không có sự sai khác với p > 0,05. Do đó, việc bổ sung muối sắt sunphat với nồng độ 0,5 g/l có tác dụng tăng hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối nấm men đồng thời đảm bảo hiệu quả kinh tế khi áp dụng lên men quy mô lớn. Đây là thông số được phù hợp để sử dụng cho quá trình lên men. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Roepcke et al. (2011) khi nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại muối tới khả năng tích lũy kẽm
trên chủng P. Guilliermondii. Theo Anderson (1988), sự có mặt của sắt có khả năng tăng cường sự tạo thành phức hợp giữa kẽm và các amino axit như methionin, glycin… có mặt trong môi trường. Luận điểm này cũng một lần nữa giải thích cho kết quả nghiên cứu về sự tăng cường hấp thu kẽm của muối sắt trong nghiên cứu của chúng tôi.
4.4. KẾT QUẢ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN LÊN MEN 4.4.1. Kết quả lựa chọn nhiệt độ 4.4.1. Kết quả lựa chọn nhiệt độ
Nhiệt độ là một trong các yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Mỗi sinh vật chỉ có thể sinh trưởng và phát triển ở ngưỡng nhiệt nhất định. Chúng có các giới hạn nhiệt độ tối thiểu, tối thích và tối đa mà chúng có thể chịu được khác nhau. Nấm men là thuộc nhóm sinh vật ưa mát. Thông thường, chúng có thể sinh trưởng tốt trong khoảng nhiệt độ dao động từ 26oC - 32oC. Tuy nhiên, mỗi chủng nấm men cụ thể thì giá trị nhiệt độ thích hợp nhất cho chúng có thể sinh trưởng và phát triển tốt nhất có sự sai khác. Chính vì vậy, quá trình lên men trong 72 giờ các mức nhiệt độ là: 25, 28, 30 và 35oC được tiến hành khảo sát. Kết quả được trình bày ở bảng 4.6 để tìm ra nhiệt độ thích hợp nhằm thuận lợi cho quá trình lên men.
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm tích lũy
Nhiệt độ (oC)
Khối lượng sinh khối khô (g/100ml)
Hàm lượng kẽm trong sinh khối (mg/g)
25 0,94B 8,84B
28 1,01A 9,05A
30 1,02A 9,11A
35 0,81C 7,98C
(*) A, B, C, D là các giá trị thể hiện khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm trong sinh khối khô theo các mức nhiệt độ.
Các chữ cái khác nhau là khác nhau về ý nghĩ thống kê với α = 0,05
Kết quả trên cho thấy, nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn tới khả năng sinh trưởng của nấm men. Trong khoảng nhiệt độ từ 28 đến 30oC sự sinh trưởng và phát triển của chủng đạt giá trị cực đại và gần như tương đương nhau. Đây là