QUÁ TRÌNH LÊN MEN THU NHẬN SINH KHỐI NẤM MEN GIÀU KẼM
kẽm, các loại muối kẽm được khảo sát là: Zn(NO3)2, ZnSO4, ZnCl2, 3 loại muối kẽm này là các muối thường được sử dụng cho các nghiên cứu tích lũy kẽm trong tế bào nấm men. Với các dải nồng độ: 0,25; 0,5; 0,75; 1; 2g/l được bổ sung vào môi trường lên men có chứa: 3g/l cao nấm men, 3g/l dịch chiết malt, 5g/l bacto pepton, 10g/l glucose. Thí nghiệm được tiến hành trong môi trường có pH được hiệu chỉnh về 6,0 bằng dung dịch HCl 0,1M. Quá trình lên men được tiến hành ở 28°C trong 72 giờ, chế độ lắc 150vòng/phút.
Sau khi đã lựa chọn được nồng độ và nguồn muối kẽm phù hợp tiến hành lên men bổ sung muối kẽm tại các thời điểm 0, 9, 18, 27 giờ để xác định điều kiện phù hợp nhất.
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của các loại muối kẽm tới khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm tích lũy
Nồng độ muối kẽm (g/l)
Khối lượng sinh khối khô (g/100ml)
Hàm lượng kẽm trong sinh khối khô (mg/g) Zn(NO3)2 ZnSO4 ZnCl2 Zn(NO3)2 ZnSO4 ZnCl2
0 0,88aA 0,89aA 0,89aA 0,34aF 0,34aF 0,34aF 0,25 0,87aA 0,89aA 0,69bB 2,08bE 2,48aE 2,45aE 0,5 0,86aA 0,87aA 0,60bC 4,71bD 5,98aD 5,94aD 0,75 0,85aA 0,86aA 0,55bC 5,29cC 6,85aC 6,53bC 1 0,65aB 0,65aB 0,34bD 8,87bB 9,15aB 8,93bB 2 0,07aC 0,08aC 0,02bE 10,03cA 11,96aA 10,31bA
(*) A, B, C, D là các giá trị thể hiện khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm trong sinh khối khô theo các nồng độ muối kẽm.
a, b, c, d là các giá trị thể hiện khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm trong sinh khối khô theo các loại muối kẽm ở cùng nồng độ.
Các chữ cái khác nhau là khác nhau về ý nghĩ thống kê với α = 0,05
Qua bảng 4.2 kết quả về hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối nấm men trên 3 loại muối kẽm nitorat, kẽm sunphat và kẽm clorua hoàn toàn có sự sai khác, mức sai khác này là có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Kết quả này cho thấy, khả năng chuyển hóa nguồn muối kẽm tích lũy kẽm trong tế bào nấm men
S.cerevisiae CNTP 4087 với mỗi loại muối kẽm khác nhau là khác nhau. Việc sử
dụng muối kẽm sunphat và kẽm clorua cho khả năng tích lũy kẽm cao hơn muối kẽm nitorat. Hơn nữa, xét về khối lượng sinh khối khô thu được thì kẽm sunphat
thu được khối lượng sinh khối khô sau lên men cao hơn hai muối còn lại ở tất cả các nồng độ nghiên cứu. Chính vì vậy, muối kẽm sunphat được lựa chọn làm nguồn muối bổ sung cho các nghiên cứu tiếp sau.
Có thể nhận thấy, nồng độ muối kẽm bổ sung vào môi trường nuôi cấy có mối liên quan chặt chẽ với hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối. Nồng độ muối kẽm bổ sung càng cao thì hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối càng lớn. Tuy nhiên, tác dụng độc hại của kim loại này lên sinh trưởng và phát triển của tế bào lại rất rõ rệt khi tăng dần nồng độ muối kẽm. Điển hình là khi bổ sung ở nồng độ 0,25 g/l kẽm sunphat khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối chỉ đạt 2,48 mg/g, nồng độ này chưa ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của nấm men. Khi nồng độ bổ sung muối kẽm sunphat lên tới 1 và 2 g/l thì hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối có sự gia tăng mạnh tới 9,15 mg/g và 11,96 mg/g nhưng ở nồng độ 2g/l thì nấm men bị ức chế sinh trưởng hoàn toàn. Chính vì vậy, với mục tiêu thu nhận được lượng lớn sinh khối nấm men giàu kẽm thì chỉ nên lựa chọn nồng độ muối kẽm 1g/l ZnSO4 cho quá trình lên men.
Sau khi đã lựa chọn được nguồn muối kẽm phù hợp, thí nghiệm được tiếp tục tiến hành và khảo sát thời điểm bổ sung muối kẽm sao cho lượng kẽm tích lũy trong sinh khối khô đạt hiệu quả cao nhất. Theo đó, chủng nấm men được tiến hành lên men trong môi trường YM có bổ sung kẽm sunphat nồng độ 0,5 g/l tại các thời điểm 0, 9, 18 và 27 giờ. Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần, các kết quả cụ thể được trình bày ở hình 4.2.
Hình 4.2. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung muối kẽm tới khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm tích lũy
0.78 0.86 0.88 0.89 8.92 8.89 4.53 2.26 0 2 4 6 8 10 0.75 0.77 0.79 0.81 0.83 0.85 0.87 0.89 0 9 18 27 hàm lư ợ ng k ẽm t ro ng s in h kh ối k hô (m g/ g) K h ối lư ợn g si n h k hố i k hô (g /1 00 m l) Thời gian (h)
Kết quả ở hình 4.2 cho thấy, thời điểm bổ sung muối kẽm sunphat có ảnh hưởng rất lớn tới hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối nấm men. Đồng thời, thời điểm bổ sung kẽm sau 9 giờ của quá trình lên men thì hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối giảm dần. Cụ thể, hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối tại thời điểm 0 và 9 giờ của quá trình lên men dao động trong khoảng 8,92 - 8,89 mg/g nhưng tại thời điểm 18 và 27 giờ giá trị này giảm dần chỉ còn 4,53 và 2,26 mg/g sinh khối. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả của nhóm nghiên cứu Roepcke et al. (2011), khi nghiên cứu xác định ảnh hưởng bởi thời điểm bổ sung kẽm đến lượng kẽm tích lũy trong sinh khối nấm men. Đồng thời, các tác giả khác cũng cho rằng quá trình hấp thụ các ion kim loại diễn ra ở pha sớm của quá trình lên men (pha logarit), ở đó nguồn năng lượng đạt cao nhất (Waters et al., 2002).
Sau khi đánh giá ảnh hưởng của thời điểm bổ sung kẽm tới tốc độ sinh trưởng và phát triển của nấm men nhận thấy: khi bổ sung kẽm sunphat với nồng độ 1g/l ngay tại thời điểm đầu (0 giờ) của quá trình lên men có ảnh hưởng mạnh tới khả năng sinh trưởng, tạo sinh khối nấm men thể hiện ở sự sụt giảm sinh khối rõ rệt so với các thời điểm 9, 18 và 27 giờ. Bởi lẽ, ngay tại thời điểm tiếp giống nấm men cần một khoảng thời gian nhất định để thích nghi với điều kiện môi trường mới. Việc bổ sung kẽm ở nồng độ cao ngay tại thời điểm này sẽ tác động mạnh tới quá trình sinh trưởng của nấm men. Tại thời điểm bổ sung kẽm tại 9 giờ sau tiếp giống không ảnh hưởng tới tốc độ sinh trưởng của nấm men lại không làm giảm sự tích lũy kẽm trong sinh khối nên thông số này được lựa chọn cho quá trình lên men tích kẽm.