4.4.1. Kết quả lựa chọn nhiệt độ
Nhiệt độ là một trong các yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Mỗi sinh vật chỉ có thể sinh trưởng và phát triển ở ngưỡng nhiệt nhất định. Chúng có các giới hạn nhiệt độ tối thiểu, tối thích và tối đa mà chúng có thể chịu được khác nhau. Nấm men là thuộc nhóm sinh vật ưa mát. Thông thường, chúng có thể sinh trưởng tốt trong khoảng nhiệt độ dao động từ 26oC - 32oC. Tuy nhiên, mỗi chủng nấm men cụ thể thì giá trị nhiệt độ thích hợp nhất cho chúng có thể sinh trưởng và phát triển tốt nhất có sự sai khác. Chính vì vậy, quá trình lên men trong 72 giờ các mức nhiệt độ là: 25, 28, 30 và 35oC được tiến hành khảo sát. Kết quả được trình bày ở bảng 4.6 để tìm ra nhiệt độ thích hợp nhằm thuận lợi cho quá trình lên men.
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm tích lũy
Nhiệt độ (oC)
Khối lượng sinh khối khô (g/100ml)
Hàm lượng kẽm trong sinh khối (mg/g)
25 0,94B 8,84B
28 1,01A 9,05A
30 1,02A 9,11A
35 0,81C 7,98C
(*) A, B, C, D là các giá trị thể hiện khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm trong sinh khối khô theo các mức nhiệt độ.
Các chữ cái khác nhau là khác nhau về ý nghĩ thống kê với α = 0,05
Kết quả trên cho thấy, nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn tới khả năng sinh trưởng của nấm men. Trong khoảng nhiệt độ từ 28 đến 30oC sự sinh trưởng và phát triển của chủng đạt giá trị cực đại và gần như tương đương nhau. Đây là
khoảng nhiệt độ phù hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng. Hơn nữa, khả năng tích lũy kẽm có giá trị cao nhất ở nhiệt độ 30oC đạt 9,11 mg/g. Vì vậy, nhiệt độ lên men là 30oC được lựa chọn cho quá trình lên men. Đây cũng chính là mức nhiệt đã được lựa chọn cho rất nhiều các công trình nghiên cứu liên quan đến tạo sinh khối nấm men giàu kẽm (Roepcke et al., 2011; Cha and Cho, 2009).
4.4.2. Kết quả lựa chọn pH
Trong quá trình lên men các chủng nấm men thuộc Saccharomyces đều làm giảm độ pH của môi trường. Điều này lại tác động trở lại đến quá trình sinh trưởng và tích lũy kẽm của chúng. Để xác định được pH phù hợp cho quá trình sinh trưởng và tích lũy kẽm, các chủng nấm men được nuôi cấy trên môi trường cơ bản YM và bổ sung 1g/l muối kẽm tại thời điểm đầu của quá trình lên men với tỉ lệ tiếp giống là 10%. Quá trình lên men được thực hiện trong 72 giờ ở 28oC với giá trị pH ban đầu từ 4 đến 7. Kết quả được trình bày ở bảng 4.7.
Bảng 4.7. Ảnh hưởng của pH tới khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm tích lũy
pH Khối lượng sinh khối khô (g/100ml) Hàm lượng kẽm trong sinh khối (mg/g)
4 0,59D 7,64F 4,5 0,93AB 7,82E 5 0,96A 8,37D 5,5 0,97A 8,86C 6 0,88BC 9,07B 6,5 0,84C 9,22A 7 0,49E 8,83C
(*) A, B, C, D là các giá trị thể hiện khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm trong sinh khối khô theo các giá trị pH
Các chữ cái khác nhau là khác nhau về ý nghĩ thống kê với α = 0,05
Kết quả trên cho thấy giá trị pH cho chủng nấm men S. cerevisiae CNTP 4087 sinh trưởng và phát triển tốt nhất nằm trong khoảng pH 5-5,5. Tuy nhiên, khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối khô lại đạt cao nhất ở pH 6,5 với giá trị 9,22 mg/g sinh khối khô. Ở khoảng pH từ 5,5-7 quá trình sinh trưởng và tích lũy kẽm của các chủng nấm men giảm dần. Mục tiêu của nghiên cứu là tạo sinh khối nấm men chứa hàm lượng kẽm cao nên giá trị pH tại 6,5 là được lựa chọn cho quá trình lên men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm.
Các nghiên cứu khác trên thế giới cũng chỉ ra rằng, pH có ảnh hưởng tới khả năng tích lũy kẽm trong tế bào. Brady and Duncan (1994) đã chứng minh rằng khả năng bắt giữ các ion kim loại hóa trị hai của S. cerevisiae giảm khi pH < 5. pH thấp có thể làm tăng tính di động kim loại, trong khi ở mức pH trung tính hoặc kiềm các tế bào có xu hướng hình thành các oxit không hòa tan, hydroxit và cacbonat. Tác giả cho rằng ở ngưỡng pH từ 5-9 là thuận lợi cho quá trình tích lũy sinh học các ion kim loại trong tế bào. Trên cơ sở đó, Roepcke et al. (2001) đã tiến hành tối ưu hóa điều kiện môi trường trên chủng P. guilliermondii trên môi trường Soybean molasses: 5◦bric; 5g/l (NH4)2SO4; 5g/l cao nấm men; 5g/l KH2PO4 5; 0,5g/l MgSO4, 10g/l ZnSO4; 0,1g/l Fe2(SO4)3 với 2 giá trị pH là 6 và 7. Kết quả cho thấy ở ngưỡng pH này cho khả năng hấp thụ tốt và không có sự sai khác giữa 2 giá trị pH đã chọn (Roepcke et al., 2001). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Cha and Cho (2009) về ảnh hưởng của pH tới khả năng tích lũy kẽm trên chủng S. cerevisiae FF10.
4.4.3. Kết quả lựa chọn chế độ lắc
Sự khuấy lắc khi lên men sẽ làm tăng lượng oxy hòa tan trong môi trường và làm tăng khả năng tiếp xúc của các tế bào nấm men với các nguồn dinh dưỡng. Hầu hết nấm men thuộc chi Saccharomyces là sinh vật yếm khí tùy tiện. Trong môi trường có đủ oxy, nấm men sẽ tiến hành hô hấp, sinh trưởng để tăng số lượng tế bào, tăng sinh khối. Khi môi trường thiếu oxy, chúng tiến hành lên men đường thành rượu. Để đánh giá ảnh hưởng của tốc độ lắc tới sự sinh trưởng và gia tăng lượng sinh khối của nấm men, các chế độ lắc được nghiên cứu trong khoảng từ 0 – 200 rpm. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.8.
Bảng 4.8. Ảnh hưởng của chế độ lắc tới khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm tích lũy
Chế độ lắc (Vòng/phút)
Khối lượng sinh khối (g/100ml)
Hàm lượng kẽm trong sinh khối (mg/g)
0 0,51C 6,35C
50 0,97B 8,64B
150 1,15A 9,06A
200 1,16A 9,11A
(*) A, B, C, D là các giá trị thể hiện khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm trong sinh khối khô theo các chế độ lắc.
Các chữ cái khác nhau là khác nhau về ý nghĩ thống kê với α = 0,05
Từ bảng trên cho thấy, quá trình khuấy lắc làm tăng khả năng hòa tan oxi trong môi trường nuôi cấy. Điều này ảnh hưởng trực tiếp tới tốc độ sinh trưởng của nấm men. Phân tích ảnh hưởng của tốc độ lắc tới khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối, khi tốc độ lắc tăng lên từ 0 lên đến 150 vòng/phút hàm lượng kẽm tích lũy và sinh khối nấm men tăng lên đáng kể. Tuy nhiên, giá trị này tăng không đáng kể khi tốc độ lắc lên đến 200 vòng/phút. Chính vì vậy, chế độ lắc tại 150 vòng/phút được sử dụng làm thông số kỹ thuật cho các lần lên men tiếp theo.
4.4.4. Kết quả tối ưu hóa điều kiện lên men
Trong các thí nghiệm trên, các yếu tố như glucose, cao nấm men, hàm lượng kẽm, nhiệt độ, pH... đã được nghiên cứu ảnh hưởng tới quá trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm. Nhận thấy 3 yếu tố như nồng độ muối kẽm bổ sung vào môi trường nuôi cấy, glucose, cao nấm men có ảnh hưởng lớn tới hàm lượng kẽm tích lũy và khối lượng sinh khối thu được sau lên men. Vì vậy, trong nghiên cứu này giá trị miền khảo sát ba yếu tố để tiến hành thí nghiệm tối ưu hóa
quá trình lên men tích kẽm như sau: X1: glucose 10 – 100 g/l, X2: cao nấm men 5 – 15g/l, nồng độ muối kẽm trong môi trường nuôi cấy X3: 0,5 – 1,5 g/l. Mô hình thiết kế ma trận thực nghiệm, các giá trị khối lượng sinh khối Y1 (g/100ml) và hàm lượng kẽm trong sinh khối là Y2 (mg/g) và sau lên men ở các điều kiện khác nhau được thể hiện ở bảng 4.9.
Bảng 4.9. Khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm tích lũy sau lên men ở các điều kiện khác nhau
Thí nghiệm X1 X2 X3 Y1 Y2 1 10 5 0,5 0,65 5,23 2 10 5 1,0 0,65 8,15 3 10 5 1,5 0,57 11,45 4 10 10 0,5 0,69 4,93 5 10 10 1,0 0,67 7,78 6 10 10 1,5 0,61 11,35 7 10 15 0,5 0,66 4,73 8 10 15 1,0 0,65 7,45 9 10 15 1,5 0,57 10,33 10 50 5 0,5 0,84 5,83 11 50 5 1,0 0,84 9,20 12 50 5 1,5 0,69 12,38 13 50 10 0,5 0,95 5,20 14 50 10 1,0 0,81 8,48 15 50 10 1,5 0,81 11,05 16 50 15 0,5 0,95 4,93 17 50 15 1,0 0,95 6,30 18 50 15 1,5 0,79 10,78 19 100 5 0,5 1,03 6,23 20 100 5 1,0 1,01 9,75 21 100 5 1,5 0,95 12,28 22 100 10 0,5 1,21 5,38 23 100 10 1,0 1,17 8,08 24 100 10 1,5 0,96 10,13 25 100 15 0,5 1,18 4,10 26 100 15 1,0 1,14 5,88 27 100 15 1,5 0,95 9,33
Hình 4.5. Thí nghiệm tối ưu hóa quá trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm
Từ các giá trị thực nghiệm thu được (bảng 4.9) và quá trình xử lí số liệu (hình 4.6), phần mềm JMP đã xác định được phương trình đường cong của mô hình bề mặt đáp ứng của hàm lượng kẽm trong sinh khối như sau: Y2 = 4,07 – 0,185X2 + 5,835X3 – 0,002X1X2. Đường cong này cho thấy mối quan hệ giữa các yếu tố là đáng tin cậy với hệ số tương quan R2 = 0,98. Mô hình có thể dự đoán giá trị Y2 với độ chính xác cao 98%.
(A)
(B)
Hình 4.6. Kết quả phân tích JMP về hàm lượng kẽm trong sinh khối (A), khối lượng sinh khối (B) và các hệ số hồi quy thu được từ thực nghiệm
Kết quả phân tích cho thấy nồng độ kẽm sunphat bổ sung vào môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng tới hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối. Khi bổ sung lượng muối kẽm vào môi trường nuôi cấy càng cao thì hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối càng nhiều. Tuy nhiên, việc bổ sung muối kẽm ở nồng độ từ 0,5 – 1,5g/l có ảnh hưởng tới khối lượng sinh khối nấm men thu được. Cụ thể khi bổ sung kẽm sunphat ở nồng độ tới 1,5g/l gây tác động ức chế sinh trưởng và phát triển trên chủng S.cerevisiae CNTP 4087. Kết quả nghiên cứu này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của Sillerova et al. (2012) khi nghiên cứu ảnh hưởng của 3 loại muối kẽm vô cơ tới khả năng tích lũy kẽm và khối lượng sinh khối nấm men. Cao nấm men có ảnh hưởng tới sự tích lũy kẽm trong sinh khối và khối lượng sinh khối nấm men thu được. Kết quả phân tích JMP cho thấy, việc bổ sung cao nấm men ở các nồng độ nghiên cứu có ảnh hưởng tích cực tới khối lượng sinh khối sau lên men. Tuy nhiên, khi bổ sung nguồn dưỡng chất này ở nồng độ cao lên tới 1,5g/l gây kìm hãm quá trình hấp thu kẽm nhưng khả năng ức chế hấp thu này là không nhiều. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Roepcke et al. (2011). Đồng thời Brady and Ducan (1994) đã chỉ ra rằng cao nấm men có ảnh hưởng tích cực tới sự sinh trưởng của nấm men và hấp thu kẽm trong sinh khối. Tuy nhiên, ở nồng độ cao chúng có thể liên kết trực tiếp với ion kim loại trong môi trường nuôi cấy gây giảm hấp thu kẽm trong nấm men.
Nồng độ glucose không ảnh hưởng tới khả năng hấp thu kẽm trong sinh khối nhưng lại ảnh hưởng trực tiếp tới tốc độ sinh trưởng của nấm men cũng như khối lượng sinh khối (Y1) thu được (hình 4.6). Glucose và cao nấm men là nguồn cung cấp dưỡng chất thiết yếu cho sự sinh trưởng của vi sinh vật nên việc bổ sung lượng vừa đủ nguồn dinh dưỡng này đảm bảo cho nấm men sinh trưởng, hấp thu kẽm với hàm lượng cao là rất cần thiết.
Tối ưu hóa điều kiện lên men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm
Có thể nhận thấy, có mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ kẽm bổ sung trong môi trường nuôi cấy với lượng kẽm trong sinh khối, giữa nồng độ glucose với khối lượng sinh khối. Nồng độ muối kẽm sunphat trong môi trường nuôi cấy càng cao thì lượng kẽm tích lũy trong sinh khối càng lớn, tuy nhiên khi nồng độ kẽm tăng đạt mức nhất định sẽ có ảnh không thuận lợi đến khả năng tích lũy sinh khối của nấm men. Với mục tiêu chính của đề tài là lựa chọn điều kiện tối ưu để thu nhận được lượng lớn sinh khối nấm men với khả năng tích lũy kẽm
cao nên mục tiêu cụ thể đặt ra của quá trình lên men là thu được hàm lượng kẽm trong sinh khối khô đạt 12 mg/g sao cho lượng sinh khối nấm men thu được càng cao càng tốt. Dữ liệu thực nghiệm ở bảng 4.9 được dùng làm đầu vào cho quá trình phân tích điểm tối ưu, sử dụng phần mềm JMP trong tính toán, kết quả thu được như sau: Nồng độ kẽm trong môi trường nuôi cấy: 1,5 g/l, nồng độ glucose: 100 g/l và cao nấm men: 5g/l (hình 4.7).
Hình 4.7. Điều kiện tối ưu và hiệu xuất dự kiến bởi phần mềm JMP
Các thông số tối ưu trên được tiến hành kiểm chứng trên thiết bị lên men 20l (Solaris Biotech Solutions, Italia). Tiến hành thực nghiệm 3 lần, kết quả cho thấy hàm lượng kẽm trung bình trong sinh khối đạt 12,06 ± 0,5 mg/g. Theo dự đoán ở điều kiện tối ưu bằng phần mềm JMP, hàm lượng kẽm trong sinh khối sẽ nằm trong khoảng từ 11,79 đến 13,01mg/g. Như vậy, kết quả thực nghiệm là phù hợp với dự đoán. Kết quả này một lần nữa khẳng định việc sử dụng phương pháp toán học quy hoạch thực nghiệm hoàn toàn có ý nghĩa và mang lại hiệu quả cao trong nghiên cứu.
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN
Qua quá trình thực hiện đề tài chúng tôi đưa ra một số kết luận như sau: Từ 96 chủng nấm men thuộc Saccharomyces được tiếp nhận từ trung tâm Vi sinh vật công nghiệp - Viện Công nghiệp thực phẩm, chủng S.cerevisiae
CNTP 4087 được sàng lọc có khả năng tích luỹ kẽm cao trong sinh khối đạt 8,91 mg/g sinh khối khô.
Nguồn muối kẽm sử dụng cho quá trình lên men là muối ZnSO4 với nồng độ 1g/l được bổ sung vào thời điểm 9h tính từ lúc bắt đầu quá trình lên men.
Để tăng khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối nấm men các nguồn dinh dưỡng và thành phần môi trường lên men bao gồm:
+ Nguồn cacbon là đường glucose với nồng độ 100g/l; + Nguồn nitơ là cao nấm men với nồng độ 10g/l;
+ Ion kim loại được bổ sung vào môi trường nuôi cấy bao gồm: MgSO4 với nồng độ 0,5g/l, KH2PO4 với nồng độ 3g/l và Fe2(SO4)3 với nồng độ 0,5g/l.
Điều kiện lên men gồm: Nhiệt độ lên men là 30oC, pH môi trường là 6,5 và chế độ lắc là 150 vòng/phút.
Điếu kiện tối ưu quá trình lên men cho hàm lượng kẽm trong sinh khối khô đạt 12 mg/g và lượng sinh khối nấm men thu được là cao nhất bao gồm: Nồng độ kẽm trong môi trường nuôi cấy: 1,5 g/l, nồng độ glucose: 100 g/l và cao nấm men: 5g/l.
5.2. KIẾN NGHỊ
Do điều kiện và thời gian nghiên cứu có hạn nên chúng tôi bước đầu đạt được kết quả như trên. Do đó chúng tôi có một số đề nghị sau:
− Mở rộng quy mô sàng lọc, tuyển chọn và phân lập thêm các chủng nấm men có khả năng tích luỹ kẽm tốt.
− Nghiên cứu thêm các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm như: tỷ lệ tiếp giống, độ oxy hoà tan, thời gian lên men…
− Tiến hành thực nghiệm quá trình lên men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm ở quy mô lớn hơn để vận dụng trong thực tiễn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt:
1. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Chiến và Phạm Văn Ty (2002). Vi sinh vật học. Nhà xuất bản giáo dục, Hà Nội. tr. 148 – 157.
2. Cao Thị Thu Hương, Nguyễn Xuân Ninh và Nguyễn Văn Nhiên (2004). Hiệu quả