vật liệu
Sau khi kết thúc thí nghiệm ở ngày thứ 21, toàn bộ mẫu trong khoang catot được rửa lặp lại 3 lần với nước cất đề ion bằng cách ly tâm ở tốc độ12000 rpm trong 10 phút (K-5418R, Effendorf, Hamburg, Đức) để chuẩn bị cho các phân tích để đặc trưng hóa vật liệu. Các phân tích này bao gồm : phân tích hình thái, cấu trúc hạt trên kính hiển vi điện tử quét, kính hiển vi điện tử truyền qua;
λ
phân tích thành phần cấu trúc hạt thông qua phổ tán sắc năng lượng; phân tích dạng tinh thể dựa trên phổ nhiễu xạ tia X; cuối cùng phân tích hấp thụ tử ngoại - khả kiến để xác định tính chất vật lý của hạt nghiên cứu.
3.4.3.1. Kính hiển vi điện tử quét (SEM)
Kính hiển vi điện tử quét SEM (Scanning Electron Microscope) được dùng để khảo sát hình thái bề mặt và cấu trúc lớp mỏng dưới bề mặt.
Nguyên lý: Dùng một chùm điện tử hẹp quét trên bề mặt mẫu vật nghiên cứu, sẽ có các bức xạ thứ cấp phát ra gồm: điện tử thứ cấp, điện tử tán xạ ngược, điện tử Auger, tia X,… Việc tạo ảnh của mẫu vật được thực hiện thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ các chùm điện tử với bề mặt mẫu vật. Chùm điện tử bị tán xạ mạnh khi đi vào trường thế biến thiên đột ngột do đám mây điện tử mang điện tích âm, hạt nhân và nguyên tử mang điện tích dương. Mỗi nguyên tử cũng trở thành tâm tán xạ của chùm điện tử. Nhiễu xạ chùm điện tử có những đặc điểm rất thích hợp cho việc nghiên cứu cấu trúc màng mỏng (Lê Văn Vũ, 2004). Ưu điểm của phương pháp SEM là xử lý đơn giản, không phải phá hủy mẫu.
Chuẩn bị mẫu chụp ảnh SEM: mẫu vật được nhỏ và để khô trên các tấm
silicon wafer để chuẩn bị cho phân tích dưới kính hiển vi điện tử quét (Hitachi S4800 Nhật Bản).
3.4.3.2. Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscope) là một thiết bị nghiên cứu vi cấu trúc vật rắn, sử dụng chùm điện tử có năng lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng và sử dụng các thấu từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (có thể lên đến hàng triệu lần), ảnh tạo ra trên màn huỳnh quang hay trên phim quang học hoặc thiết bị kỹ thuật số (Nguyễn Kim Giao, 2004).
Nguyên lý: ảnh của TEM vẫn được tạo theo các cơ chế quang học, nhưng tính chất ảnh tùy thuộc vào từng chế độ ghi ảnh. Điểm khác cơ bản của ảnh TEM so với ảnh quang học là độ tương phản khác so với ảnh trong kính hiển vi quang học và các loại kính hiển vi khác. Nếu như ảnh trong kính hiển vi quang học có độ tương phản chủ yếu đem lại do hiệu ứng hấp thụ ánh sáng thì độ tương phản của ảnh TEM lại chủ yếu xuất phát từ khả năng tán xạ điện tử. Các chế độ tương phản trong TEM:
Tương phản biên độ: Đem lại do hiệu ứng hấp thụ điện tử (do độ dày, do thành phần hóa học) của mẫu vật. Kiểu tương phản này có thể gồm tương phản độ dày, tương phản nguyên tử khối (trong STEM).
Tương phản pha: Có nguồn gốc từ việc các điện tử bị tán xạ dưới các góc khác nhau – nguyên lý này rất quan trọng trong các hiển vi điện tử truyền qua phân giải cao (HRTEM) hoặc trong các Lorentz TEM sử dụng cho chụp ảnh cấu trúc từ.
Chuẩn bị mẫu chụp ảnh TEM: một giọt dung dịch mẫu được nhỏ lên
trên lưới đồng đã phủ màng cácbon, để khô trong không khí, chờ quan sát dưới kính hiển vi TEM ( JEOL JEM-1010, Nhật Bản).
3.4.3.3. Phổ tán sắc năng lượng tia X (EDX)
Trong đề tài này, để xác định thành phần các nguyên tử của các nguyên tố có mặt trong vật liệu nano chúng tôi sử dụng kĩ thuật đo phổ tán sắc năng lượng EDS (Energy Dispersive Spectroscopy) hay phổ tán sắc năng lượng tia X (EDX)
Nguyên lý của phương pháp là dựa vào tính năng quan trọng khác của SEM để phân tích thành phần vật liệu. Như ta đã biết một chùm điện tử có năng lượng cao khi bắn vào mẫu sẽ có tương tác với các lớp điện tử bên trong các nguyên tử của mẫu và phát ra các tia X đặc trưng cho từng nguyên tố. Dựa vào việc phân tích các tia X đặc trưng này ta sẽ phát hiện ra các nguyên tố bên trong mẫu vật và có thể tính được tỷ phần từng nguyên tố (Lê Văn Vũ, 2004).
Chuẩn bị mẫu đo EDX: mẫu vật sau khi chụp ảnh SEM được giữ lại trên
cùng thiết bị để tiếp tục phân tích phổ EDX.
3.4.3.4. Nhiễu xạ điện tử lựa chọn vùng (SAED)
Phương pháp nhiễu xạ điện tử lựa chọn vùng (Selected area diffraction - SAED) có thể cho ta biết chính xác cấu trúc tinh thể của một khối vật liệu ở một kích cỡ lớn (vì để thực hiện trên một vùng hẹp thì khó tạo ra chùm điện tử song song), nhưng đối với các cấu trúc siêu nhỏ (ví dụ các cấu trúc nano) thì khó biết được thông tin chính xác về cấu trúc tinh thể.
Nguyên lý: Nhiễu xạ điện tử lựa chọn vùng là một phương pháp nhiễu xạ sử dụng trong kính hiển vi điện tử truyền qua sử dụng một chùm điện tử song song chiếu qua một vùng chất rắn được lựa chọn. Phổ nhiễu xạ sẽ là tập hợp các điểm sáng phân bố trên các vòng tròn đồng tâm quanh tâm là vân nhiễu xạ tạo trên mặt phẳng tiêu của vật kính.
Chuẩn bị mẫu phân tích SEAD: mẫu vật sau khi chụp ảnh TEM được
giữ lại trên cùng thiết bị để tiếp tục nhiễu xạ điện tử lựa chọn vùng.
3.4.3.5. Phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD)
Phương pháp nhiễu xạ Rơnghen (X - Ray Diffraction) là phương pháp phân tích vật lý hiện đại được ứng dụng rất phổ biến để nghiên cứu cấu trúc tinh thể của các vật liệu. Khi chiếu tia X vào nguyên tử thì các điện tử sẽ dao động quanh vị trí cân bằng của chúng. Khi điện tử bị hãm (mất năng lượng) nó sẽ phát xạ tia X. Quá trình hấp phụ và tái phát bức xạ điện tử này được gọi là tán xạ. Nhiễu xạ là sự giao thoa tăng cường của nhiều hơn một sóng tán xạ. Khi chiếu tia X vào vật rắn tinh thể ta thấy xuất hiện các tia nhiễu xạ với cường độ và hướng khác nhau.
Điều kiện nhiễu xạ (điều kiện Bragg): 2dsinθ = nλ (2.4)
Trong đó:
d : khoảng cách giữa các mặt nguyên tử phản xạ, θ : góc phản xạ,
λ : bước sóng của tia X, n = 1, 2, 3, ... được gọi là bậc phản xạ.
Tập hợp các cực đại nhiễu xạ Bragg dưới các góc 2θ khác nhau có thể ghi nhận được bằng cách sử dụng đầu ghi. Căn cứ vào các cực đại nhiễu xạ trên giản đồ XRD tìm được 2θ. Từ đó suy ra d theo điều kiện Bragg. So sánh giá trị d tính được với giá trị d chuẩn sẽ xác định được thành phần cấu trúc tinh thể của vật chất. Ngoài ra, phương pháp nhiễu xạ tia X cho phép xác định kích thước tinh thể dựa trên phương pháp phân tích hình dáng và đặc điểm của đường phân bố cường độ nhiễu xạ dọc theo trục góc 2θ (Vũ Đăng Độ, 2006).
Chuẩn bị mẫu đo XRD: mẫu vật liệu được chuẩn bị dưới dạng bột để
đem đi đo XRD trên thiết bị D8 ADVANCE Bruker – Germany. Thiết bị sử dụng bức xạ Cu-Kα với bước sóng λ = 1,5406 Ao , cường độ dòng điện bằng 30 mA, điện áp 40 kV, góc quét 2θ = 10 ÷ 700 , tốc độ quét 0,03 o/s.
3.4.3.6. Phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis Absorption Spectroscopy)
Phổ hấp thụ UV-vis sử dụng ánh sáng đo có bước sóng nằm trong vùng tử ngoại và khả kiến (thường máy đo đo từ 200 đến 1100 nm). Trong vùng ánh sáng
này năng lượng của photon nằm trong vùng năng lượng chuyển tiếp điện tử giữa các orbitan của nguyên tử hay phân tử. Chính vì vậy, thông qua phổ UV-vis người ta thường xác định được độ rộng vùng cấm của vật liệu. Thông qua số đỉnh cường độ đỉnh độ mở rộng của đỉnh, người ta có thể suy ra được một số tính chất như sau: độ dày của màng (đồng đều, dày hay mỏng ...) kích thước hạt và sự phân bố kích thước hạt (đối với các hạt nano ...).
Trong luận án này, máy quang phổ UV-VIS 2450 (Shizuma, Nhật Bản) được sử dụng để đo độ hấp thụ ánh sáng của vật liệu trong dải bước sóng (200-700) nm.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. THIẾT KẾ HỆ THỐNG BES
Sau khi nghiên cứu các hệ thống điện sinh học như: MFC 2 khoang truyền thống với anot và catot tách biệt có màng trao đổi ion; MFC 2 khoang, không màng trao đổi ion và MFC 1 khoang, nhóm nghiên cứu có những nhận định sau: i) MFC 2 khoang truyền thống với có khả năng thu hồi điện tốt, thích hợp với các quần xã vi sinh vật, tuy nhiên giá thành màng trao đổi ion cao; ii) MFC 2 khoang không màng trao đổi ion được đánh giá có chi phí thấp, thiết kế đơn giản dễ ứng dụng; iii) BES1 khoang có khả năng truyền điện tử tốt, tuy nhiên, việc tiếp xúc trực tiếp có thể ảnh hưởng đến quá trình tách các vật liệu sản phẩm nano. Do đó, chúng tôi đã thiết kế hệ thống điện sinh học dạng MFC 2 khoang không màng trao đổi ion.
Bên cạnh đó, chúng tôi cũng tiến hành so sánh ưu nhược điểm của từng loại vật liệu phục vụ cho thiết kế BES đã được công bố trong những nghiên cứu trước đây (Logan et al., 2006; Logan, 2008). Để phù hợp với thiết kế đơn giản, tiết kiệm chi phí, chúng tôi lựa chọn sử dụng vật liệu tạo khung là các bình duran thủy tinh sẵn có, ưu điểm của vật liệu này là khử trùng được và dễ dàng đặt mua. Thêm nữa, chúng tôi sử dụng điện cực bằng thanh than chì đường kính 0,7cm; thanh than chì có đặc tính dẫn điện tốt hơn so với các vật liệu làm điện cực khác như vải than chì.
Thiết bị BES thí nghiệm được thiết kế theo hai cách khác nhau. Bản vẽ thiết kế của có điện cực dương kín dùng cho nghiên cứu trong môi trường kị khí và hệ BES có điện cực dương mở dùng cho nghiên cứu trong môi trường hiếu khí được trình bày trong Hình 4.1 và Hình 4.2.
Hình 4.1. Hệ thống điện sinh học có điện cực dương kị khí
Cả hai hệ thống này đều cấu tạo gồm hai khoang là khoang điện cực âm và khoang điện cực dương riêng biệt không dùng màng trao đổi ion. Điện cực làm bằng than chì, có chiều dài 16 cm trong hệ catot hiếu khí và 13 cm trong hệ catot kị khí. Hai khoang điện cực âm và dương đều được làm bằng lọ thủy tinh Duran ren ngoài 100 ml, chiều dài lọ 10 cm, đường kính 5 cm. Khoang điện cực âm được đậy kín bằng một nắp nhựa cứng ren trong có vách ngăn bằng cao su để tránh tiếp xúc với môi trường bên ngoài. Vách ngăn cao su được đục một lỗ nhỏ vừa đủ cho điện cực than chì đi qua.
Hình 4.2. Hệ thống điện sinh học có khoang điện cực dương hiếu khí 4.2. NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỘNG TRONG KHOANG ANOT
4.2.1. Sự thay đổi về mật độ tế bào trong khoang Anot
Mật độ vi khuẩn trong khoang điện cực âm của cả 3 hệ BES – catot kị khí (BES1), BES - catot hiếu khí có khuấy từ ở 250 vòng/phút (BES2) và BES catot-kị khí nối pin (BES3) được trình bày ở Hình 4.3 . Nhìn chung mật độ vi khuẩn trong môi trường anot giảm trong suốt thời gian thí nghiệm. Riêng đối với hệ BES1, mật độ vi khuẩn giảm khá nhanh trong 2 ngày đầu thí nghiệm so với các hệ BES còn lại. Sau 6 ngày thí nghiệm, mật độ vi khuẩn trong 2 hệ BES1 và BES3 đã giảm đi nhiều, lần lượt từ 0.14 và 0.026 giảm xuống còn 0.078 và 0.01; tuy nhiên mật độ vi khuẩn trong hệ BES2 giảm không đáng kể từ 0.033 xuống 0.028. Trong khi đó các hệ BES đối chứng không có sự tăng
đáng kể về OD. Kết quả theo dõi ảnh hưởng của nồng độ oxi hòa tan đối với sự tăng trưởng của chủng vi khuẩn điện hóa Shewanella sp. HN41 trong dung dịch ion Se (IV) đối với sự tạo thành hạt Se nano (Ji-Hoon Lee et al., 2007a) cũng có kết quả tương tự. Mật độ tế bào trong điều kiện kị khí giảm nhanh sau 10 ngày thí nghiệm.
Hình 4.3. Mật độ vi khuẩn trong khoang cực âm của các hệ thống BES1, BES2, BES3 và BES ĐC trong 6 ngày thí nghiệm
Kết thúc thí nghiệm khi tháo bỏ hệ BES, chúng tôi nhận thấy có lớp màng sinh học hình thành trên vách ngăn ngăn cách khoang anot với môi trường bên ngoài (Hình 4.4). Như vậy, vi khuẩn có thể tăng sinh và hình thành lớp màng sinh học trên vách ngăn chứ không di chuyển trong môi trường nuôi, điều này giải thích tại sao OD hầu như không tăng đối với các hệ BES4 và BES5 (Hình 4.5), dù các hệ vẫn được bổ sung cơ chất lactat hàng tuần.
Hình 4.4. Màng sinh học do vi khuẩn Shewanella sp. HN-41 hình thành trên vách ngăn cao su của (A) hệ thống BES4, (B) hệ thống BES5 sau khi kết thúc
thí nghiệm
Hình 4.5. Mật độ vi khuẩn trong khoang cực âm của các hệ thống BES4 và BES5 trong 14 ngày thí nghiệm
4.2.2. Tốc độ tiêu thụ lactat trong khoang Anot
Sự biến thiên nồng độ lactate tại anot trong các hệ BES1, BES2 và BES3 được trình bày trong Hình 4.6 . Có thể thấy rõ ràng rằng, với cả 3 hệ BES sử dụng vi khuẩn Shewanella sp.HN-41, nồng độ lactate tại anot giảm đều đặn và bị phân hủy hoàn toàn sau 6 ngày thí nghiệm. Trong khi đó, nồng độ lactat tại anot trong thí nghiệm đối chứng (không có vi khuẩn) hầu như không biến đổi trong
suốt thời gian thí nghiệm. Điều này chứng tỏ lactat tại anot đã bị phân hủy yếm khí hoàn toàn bởi Shewanella sp. HN-41. Bên cạnh đó, hàm lượng lactat trong BES1 giảm nhanh hơn so với các hệ còn lại có thể do mật độ vi khuẩn ban đầu trong hệ BES1 cao hơn, mà hiệu suất khử lactat trong hệ BES ở những ngày đầu cũng cao hơn so với hệ BES2 và BES3.
Hình 4.6. Sự thay đổi hàm lượng lactat trong khoang điện cực âm trong 6 ngày thí nghiệm
Lactat là một chất nền quan trọng vừa cung cấp năng lượng cho vi khuẩn sử dụng vừa là chất cho điện tử trong BES. Tại khoang anot, vi khuẩn
Shewanella sp. HN-41 sử dụng lactat cho quá trình hô hấp kị khí, phản ứng phân
hủy lactat xảy ra theo phương trình (Gajda et al., 2017):
CH3CH2OCOO- + H2O CH3COO- + CO2 + 4e- + 4H+
Điện tử sinh ra sau đó được vận chuyển trực tiếp từ màng ngoài của vi khuẩn đến điện cực, theo thế chênh lệch oxy hóa khử dẫn ra ngoài để đến catot.
4.2.3. Sự thay đổi pH trong khoang Anot
Quá trình ôxi hoá lactat trong khoang điện cực âm sản sinh proton H+, điều này giải thích cho sự suy giảm pH trong môi trường anot (Hình 4.7). pH của môi trường ban đầu trong các khoang anot do sử dụng đệm HEPES dao động trong khoảng 7,6-7,7 đã giảm xuống và ổn định ở pH 7,4.
Hình 4.7. Sự thay đổi pH trong khoang anot của các hệ BES, (A) các hệ thống BES ĐC, 1, 2 và 3; (B) BES4 và BES5
Như vậy, ở trong khoang điện cực âm đã có hiện tượng pH môi trường giảm do proton H+ được sinh ra trong quá trình hô hấp kị khí của vi khuẩn. Theo Yong et al. (2003), khả năng sinh trưởng của vi khuẩn Shewanella trong các hệ thống BES với pH thay đổi từ pH 6-9 không có sự thay đổi đáng kể. Tuy nhiên, cơ chất lactat bị tiêu thụ hết sau 6 ngày thí nghiệm, đã được bổ sung hàng tuần, tuy vậy mật độ OD vi khuẩn vẫn giảm nhẹ trong các tuần thí nghiệm tiếp theo. Nguyên nhân là do vi khuẩn tăng sinh hình thành lớp màng sinh học trên vách ngăn cao su (ngăn cách khoang anot với môi trường bên ngoài) nhưng không di chuyển vào môi trường.
4.3. NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỘNG TRONG KHOANG CATOT 4.3.1. Sự suy giảm nồng độ ion Cd2+ trong dung dịch Catot 4.3.1. Sự suy giảm nồng độ ion Cd2+ trong dung dịch Catot
Các hệ thống Shewanella-BES với catot kị khí và catot hiếu khí có khuấy từ được tiến hành nghiên cứu trong 1 tuần. Kết quả cho thấy các hệ BES1, BES2 và BES3 hầu như không có sự suy giảm về nồng độ ion Cd2+ trong mẫu thu được sau khi ly tâm dung dịch ở các catot khác nhau (Hình 4.8). Chẳng hạn như đối