Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.1. Địa điểm nghiên cứu
Địa điểm: phịng thí nghiệm bộ mơn Sinh học, khoa Công nghệ sinh học, Học viện nông nghiệp Việt Nam.
3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU Thời gian: 7/2016 – 5/2017. 3.3. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
- Giống hoa hồng Pháp (Rosa gallica L.) thu thập tại Sapa tỉnh Lào Cai. - Chế phẩm nano được cung cấp bởi bộ môn Sinh học, khoa Công nghệ sinh học, Học viện nông nghiệp Việt Nam.
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nội dung 1: Khử trùng mẫu.
Thí nghiệm 1.1: Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp nano bạc-đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp.
Thí nghiệm 1.2: Ảnh hưởng của thời gian xử hỗn hợp nano bạc-đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp.
Nội dung 2: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA và nano bạc đến
khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp.
Thí nghiệm 2.1: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp.
Thí nghiệm 2.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp.
Nội dung 3: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng IBA và nano bạc
đến q trình tạo mơ sẹo (callus) hoa hồng Pháp.
Thí nghiệm 3.1: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng IBA đến q trình tạo mơ sẹo (callus) hoa hồng Pháp.
Thí nghiệm 3.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến q trình tạo mơ sẹo (callus) hoa hồng Pháp.
Nội dung 4: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA và nano bạc đến
Thí nghiệm 4.1: Ảnh hưởng của của chất điều tiết sinh trưởng BA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp.
Thí nghiệm 4.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp.
Nội dung 5: Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng -NAA và nano bạc đến
sự ra rễ của chồi cấp 2 in vitro hoa hồng Pháp.
Thí nghiệm 5.1: Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng -NAA đến sự ra rễ của chồi cấp 2 in vitro hoa hồng Pháp.
Thí nghiệm 5.2: Ảnh hưởng nano bạc đến sự ra rễ của chồi cấp 2 in vitro
hoa hồng Pháp.
3.5. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.5.1. Thiết kế thí nghiệm 3.5.1. Thiết kế thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí gồm 5 cơng thức, mỗi công thức lặp lại 3 lần, số mẫu thí nghiệm cho mỗi cơng thức là 20.
Sử dụng mơi trường MS có bổ sung 6,5g agar/l, 30g sucrose/l, pH=5,8, các chất điều tiết sinh trưởng và nano bạc. Môi trường trước khi sử dụng để nuôi cấy
được hấp khử trùng ở 121oC, 1atm trong 20 phút.
3.5.2. Các chỉ tiêu nghiên cứu
Tỉ lệ mẫu sạch (%) = (Tổng số mẫu sạch/Tổng số mẫu thí nghiệm)*100. Tỉ lệ mẫu sống sạch (%) = (Tổng số mẫu sống sạch/Tổng số mẫu thí nghiệm)*100.
Tỉ lệ số mô bật chồi (%) = (Tổng số mơ bật chồi/Tổng số mẫu thí nghiệm) *100.
Tỉ lệ mẫu nhiễm (%) = (Tổng số mẫu nhiễm/Tổng số mẫu thí nghiệm)*100.
Tỉ lệ mẫu tạo callus (%) = (Tổng số mẫu tạo callus/Tổng số mẫu thí nghiệm)*100.
Hệ số nhân chồi = Số chồi nhân lên/Tổng số mẫu ban đầu.
Tỉ lệ chồi ra rễ (%) = (Tổng chồi ra rễ/Tổng số mẫu in vitro)*100. Chiều dài trung bình của chồi (cm) = Tổng chiều dài của chồi/Số chồi.
Số lá/chồi = tổng số lá của chồi/Số chồi.
Chiều dài trung bình của rễ (cm) = Tổng chiều dài của rễ/Số rễ. 3.5.3. Bố trí thí nghiệm
3.5.3.1. Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu
Trước khi tiến hành thực hiện thí nghiệm nghiên cứu khả năng khử trùng mẫu của nồng độ và thời gian xử lý hỗn hợp nano. Chúng tôi thực hiện các bước sau:
B1. Rửa sạch mẫu dưới vòi nước chảy cho sạch bụi đất.
B2. Đưa mẫu vào phịng ni và rửa lại bằng nước cất vô trùng thêm 2-3 lần nữa.
B3. Cho mẫu vào box cấy, đổ ngập cồn 70o trong 1 phút.
B5. Rửa lại bằng nước cất vô trùng 2-3 lần cho sạch cồn.
Thí nghiệm 1.1: Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp nano bạc-đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp
Khử trùng mẫu với các công thức khác nhau:
- CT1: javen thương mại 5% lắc mẫu trong vòng 5 phút (đối chứng).
- CT2: dung dịch hỗn hợp nano bạc–đồng 100 ppm.
- CT3: dung dịch hỗn hợp nano bạc–đồng 150 ppm.
- CT4: dung dịch hỗn hợp nano bạc–đồng 200 ppm.
- CT5: dung dịch hỗn hợp nano bạc–đồng 250 ppm.
(CT2, CT3,CT4, CT5 thực hiện trong 1 giờ, cú 15 phút lắc một lần).
Mẫu được theo dõi ở thời điểm sau 2, 3, 4 tuần ni cấy, các thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần tiên tiếp, mỗi cơng thức thí nghiệm 20 mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sạch, tỷ lệ mẫu sống.
Thí nghiệm 1.2: Ảnh hưởng của thời gian xử lý hỗn hợp nano bạc-đồng đến
hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp.
Sử dụng nồng độ hỗn hợp nano tốt nhất ở thí nghiệm 1.1 và xử lý ở 5 thời gian khác nhau là (30, 45, 60, 75, 90 phút) tương ứng với 5 công thức.
Mẫu được theo dõi ở thời điểm sau 2, 3, 4 tuần ni cấy, các thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần liên tiếp, mỗi cơng thức thí nghiệm 20 mẫu.
3.5.3.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA và nano bạc đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp
Thí nghiệm 2.1: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA đến khả năng
tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp.
Đoạn thân mang mắt ngủ sau khi được khử trùng ở nồng độ và thời gian hỗn hợp nano bạc -đồng thích hợp nhất ở thí nghiệm (3.5.3.1.) được dùng để tái sinh chồi.
Chất điều tiết sinh trưởng BA được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với 5 công thức tương ứng như sau:
CT1: MS + 0,05 mg/l -NAA + 30 g/l sucrose + 0,0 mg/l BA. CT2: MS + 0,05 mg/l -NAA + 30 g/l sucrose + 1,0 mg/l BA. CT3: MS + 0,05 mg/l -NAA + 30 g/l sucrose + 1,5 mg/l BA. CT4: MS + 0,05 mg/l -NAA + 30 g/l sucrose + 2,0 mg/l BA. CT5: MS + 0,05 mg/l -NAA + 30 g/l sucrose + 2,5 mg/l BA.
Thí nghiệm được bố trí gồm 5 cơng thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu.
Mẫu được đánh giá sau 2, 3,4 tuần trên môi trường nuôi cấy.
Chỉ tiêu theo dõi:Tỷ lệ tái sinh chồi (%), hệ số nhân chồi (lần), chiều cao trung bình của chồi (cm), số lá/chồi.
Sau khi xử lý số liệu thu được sẽ tìm được công thức với nồng độ BA thích hợp nhất (M1) cho sự tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ.
Thí nghiệm 2.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến khả năng tái sinh chồi từ
đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp.
Sau khi tìm được mơi trường có nồng độ BA thích hợp nhất cho bật chồi hoa hồng Pháp là M1, chúng tơi tiếp tục bố trí thí nghiệm để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano bạc được bổ sung vào môi trường M1 đến sự tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ với các nồng độ nano bạc tương ứng như sau:
CT1: M1 + 0 ppm NS. CT2: M1 + 2 ppm NS. CT3: M1 + 4 ppm NS. CT4: M1 + 6 ppm NS.
CT5: M1 + 8 ppm NS.
Thí nghiệm được bố trí gồm 5 cơng thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu.
Mẫu được đánh giá sau 2, 3, 4 tuần trên môi trường nuôi cấy.
Chỉ tiêu theo dõi:Tỷ lệ tái sinh chồi (%), hệ số nhân chồi (lần), chiều cao trung bình của chồi (cm), số lá/chồi.
3.5.3.3.. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng IBA và nano bạc đến q trình tạo mơ sẹo (callus) hoa hồng Pháp.
Thí nghiệm 3.1: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng IBA đến q trình
tạo mơ sẹo (callus) hoa hồng Pháp.
Để nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng hình thành mơ sẹo của
mẫu lá cây hoa hồng in vitro, lá mầm in vitro có kích thước khoảng 0,5 cm-1,5
cm được cắt bỏ răng cưa và tạo vết thương được đưa vào môi trường tạo callus được bố trí với 5 nồng độ IBA khác nhau tương ứng 5 CT như sau:
CT1: MS + 30g/l sucrose + 0,0 mg/l IBA. CT2: MS + 30g/l sucrose + 0,1 mg/l IBA. CT3: MS + 30g/l sucrose + 0,3 mg/l IBA. CT4: MS + 30g/l sucrose + 0,5 mg/l IBA. CT5: MS + 30g/l sucrose + 0,7 mg/l IBA.
Thí nghiệm được bố trí gồm 5 cơng thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu.
Đánh giá mẫu sau 4, 5, 6 tuần trên môi trường nuôi cấy để xác định chỉ tiêu: Tỷ lệ mẫu tạo callus.
Sau khi có kết quả, chúng tơi tìm ra cơng thức phù hợp nhất (M2) cho q trình tạo mơ sẹo từ lá in vitro.
Thí nghiệm 3.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến q trình tạo mơ sẹo
(callus) hoa hồng Pháp.
Sau khi tìm được mơi trường bổ sung BA phù hợp nhất cho quá trình tạo mơ sẹo hoa hồng Pháp là M2, chúng tơi tiếp tục bố trí thí nghiệm để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano được bổ sung vào mơi trường M2 đến q trình tạo mô sẹo với các nồng độ nano như sau:
CT1: M2 + 0 ppm NS. CT2: M2 + 2 ppm NS. CT3: M2 + 4 ppm NS. CT4: M2 + 6 ppm NS. CT5: M2 + 8 ppm NS.
Thí nghiệm được bố trí gồm 5 cơng thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu.
Đánh giá mẫu sau 4, 5, 6 tuần trên môi trường nuôi cấy để xác định chỉ tiêu: Tỷ lệ tạo callus.
3.5.3.4. Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA và nano bạc đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp
Thí nghiệm 4.1: Ảnh hưởng của của chất điều tiết sinh trưởng BA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp.
Chồi được bật ra từ mắt ngủ có chiều dài khoảng 1,5 - 2,0 cm, số lá là 3–4 lá được cắt ra và nuôi trong mơi trường tái sinh chồi in vitro có bổ sung BA với các nồng độ khác nhau tương ứng 5 CT như sau:
CT1: MS + 30 g/l sucrose + 0,0 mg/l BA. CT2: MS + 30 g/l sucrose + 0,5 mg/l BA. CT3: MS + 30 g/l sucrose + 1,0 mg/l BA. CT4: MS + 30 g/l sucrose + 1,5 mg/l BA. CT5: MS + 30 g/l sucrose + 2,0 mg/l BA.
Thí nghiệm được bố trí gồm 5 cơng thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi: Đánh giá mẫu sau 2, 3, 4, 5, 6 tuần nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy để xác định các chỉ tiêu: Hệ số nhân chồi (lần), chiều cao trung bình của chồi (cm), số lá/chồi.
Sau khi xử lý số liệu, chúng tơi tìm được ra cơng thức thích hợp nhất (M3) cho quá trình tái sinh chồi in vitro.
Thí nghiệm 4.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp.
nhân chồi in vitro hoa hồng Pháp là M3, em tiếp tục bố trí thí nghiệm để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano được bổ sung vào mơi trường M3 đến q trình nhân chồi in vitro hoa hồng Pháp với các nồng độ nano như sau:
CT1: M3 + 0 ppm NS. CT2: M3 + 2 ppm NS. CT3: M3 + 4 ppm NS. CT4: M3 + 6 ppm NS. CT5: M3 + 8 ppm NS.
Thí nghiệm được bố trí gồm 5 cơng thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi: Đánh giá mẫu sau 2, 3, 4, 5, 6 tuần nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy để xác định các chỉ tiêu: Hệ số nhân chồi (lần), chiều cao trung bình của chồi (cm), số lá/chồi.
3.5.3.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng -NAA và nano
bạc đến sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp
Thí nghiệm 5.1: Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng -NAA đến sự ra
rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp.
Chồi bật ra từ mắt ngủ được chuyển sang môi trường nhân nhanh, sau 6 tuần cắt các chồi chuyển sang ni trong mơi trường ra rễ có bổ sung -NAA với các nồng độ khác nhau tương ứng 5 CT như sau:
CT1: ¼ MS + 1g/l than hoạt tính + 0mg/l -NAA. CT2: ¼ MS + 1g/l than hoạt tính + 1mg/l -NAA. CT3: ¼ MS + 1g/l than hoạt tính + 2mg/l -NAA. CT4: ¼ MS + 1g/l than hoạt tính + 3mg/l -NAA. CT5: ¼ MS + 1g/l than hoạt tính + 4mg/l -NAA.
Thí nghiệm được bố trí gồm 5 cơng thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu theo dõi sự phát triển ra rễ sau 4, 5, 6 tuần.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ chồi ra rễ, chiều cao trung bình của rễ (cm), số rễ/chồi.
Sau khi xử lý kết quả thu được sẽ tìm được mơi trường có nồng độ -
Thí nghiệm 5.2: Ảnh hưởng nano bạc đến sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp
Sau khi tìm được mơi trường có nồng độ -NAA thích hợp nhất, em tiếp tục bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano bạc được bổ sung vào môi trường M4 tới sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp với các công thức như sau: CT1: M4 + 0 ppm NS. CT2: M4 + 2 ppm NS. CT3: M4 + 4 ppm NS. CT4: M4 + 6 ppm NS. CT5: M4 + 8 ppm NS.
Thí nghiệm được bố trí gồm 5 cơng thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu theo dõi sư phát triển ra rễ sau 4, 5, 6 tuần.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ chồi ra rễ, chiều cao trung bình của rễ (cm), số rễ/chồi.
3.5.4. Phân tích số liệu
- Các số liệu được xử lý thô trên Microsoft Office Excel 2007.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHỬ TRÙNG MẪU HOA HỒNG PHÁP CỦA HỖN HỢP DUNG DỊCH NANO BẠC-ĐỒNG CỦA HỖN HỢP DUNG DỊCH NANO BẠC-ĐỒNG
4.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp nano bạc-đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp trùng mẫu hoa hồng Pháp
Để đánh giá khả năng khử trùng mẫu của dung dịch nano bạc–đồng khác nhau, các đoạn thân mang mắt ngủ được lắc trong hỗn hợp nano tương ứng (0, 100, 150, 200, 250 ppm) trong 60 phút. Công thức 1(CT1- ĐC) sử dụng dung dịch javen 5% làm đối chứng. Sau 4 tuần theo dõi thu được kết quả thể hiện ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp nano bạc-đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp (sau 4 tuần)
CT NS/NC (ppm) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu sạch (%) Tỷ lệ mẫu sống sạch (%) CT1 ĐC 80,00±0,40a 20,00± 0,40d 20,00±0,40e CT2 100 65,00±0,47b 35,00±0,47c 35,00±0,47d CT3 150 51,67±0,50c 48,33±0,50b 48,33±0,50c CT4 200 10,00±0,30d 90,00±0,30a 90,00±0,30a CT5 250 5,00±0,22d 95,00±0,22a 70,00±0,47b LSD0,05 6,4 6,4 9,0 CV% 4,0 3,0 4,7
Ghi chú: So sánh các giá trị trong cùng một cột, các giá trị công thức mang cùng một chữ cái thì khác nhau khơng có ý nghĩa, các giá trị cơng thức mang khác chữ thì khác có ý nghĩa ở mức α = 0, 05.
Từ kết quả thu được ở bảng 4.1 cho thấy, hỗn hợp nano bạc-đồng có khả năng khử trùng vào mẫu ở tất cả nồng độ sử dụng, tỉ lệ mẫu sống sạch dao động từ 35% đến 90%; đặc biệt cơng thức 4 (200 ppm) có tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ mẫu sống sạch đều là 90%. Tỷ lệ này cao hơn rất nhiều so với công thức đối chứng sử dụng Javen 5% (20%). Ở công thức 5 (250 ppm) mặc dù cho tỷ lệ mẫu sạch đạt 95%, khơng sai có ý nghĩa về mặt thống kê với cơng thức 4 (90%). Tuy nhiên ở công thức này tỷ lệ mẫu sống sạch chỉ đạt 70% trong khi đó ở cơng thức 4 tỷ lệ
sống là 90%. Sở dĩ có kết quả như vậy, theo chúng tơi khi nồng độ nano tăng thì khả năng diệt khuẩn và nấm cũng tăng lên nhưng lại ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây, ức chế cây, do đó tỷ lệ mẫu chết tăng lên tỷ lệ mẫu sống sạch