Các chỉ tiêu nghiên cứu

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.5. Phương pháp thí nghiệm

3.5.2. Các chỉ tiêu nghiên cứu

Tỉ lệ mẫu sạch (%) = (Tổng số mẫu sạch/Tổng số mẫu thí nghiệm)*100. Tỉ lệ mẫu sống sạch (%) = (Tổng số mẫu sống sạch/Tổng số mẫu thí nghiệm)*100.

Tỉ lệ số mơ bật chồi (%) = (Tổng số mơ bật chồi/Tổng số mẫu thí nghiệm) *100.

Tỉ lệ mẫu nhiễm (%) = (Tổng số mẫu nhiễm/Tổng số mẫu thí nghiệm)*100.

Tỉ lệ mẫu tạo callus (%) = (Tổng số mẫu tạo callus/Tổng số mẫu thí nghiệm)*100.

Hệ số nhân chồi = Số chồi nhân lên/Tổng số mẫu ban đầu.

Tỉ lệ chồi ra rễ (%) = (Tổng chồi ra rễ/Tổng số mẫu in vitro)*100. Chiều dài trung bình của chồi (cm) = Tổng chiều dài của chồi/Số chồi.

Số lá/chồi = tổng số lá của chồi/Số chồi.

Chiều dài trung bình của rễ (cm) = Tổng chiều dài của rễ/Số rễ. 3.5.3. Bố trí thí nghiệm

3.5.3.1. Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu

Trước khi tiến hành thực hiện thí nghiệm nghiên cứu khả năng khử trùng mẫu của nồng độ và thời gian xử lý hỗn hợp nano. Chúng tôi thực hiện các bước sau:

B1. Rửa sạch mẫu dưới vòi nước chảy cho sạch bụi đất.

B2. Đưa mẫu vào phịng ni và rửa lại bằng nước cất vô trùng thêm 2-3 lần nữa.

B3. Cho mẫu vào box cấy, đổ ngập cồn 70o trong 1 phút.

B5. Rửa lại bằng nước cất vơ trùng 2-3 lần cho sạch cồn.

Thí nghiệm 1.1: Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp nano bạc-đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp

Khử trùng mẫu với các công thức khác nhau:

- CT1: javen thương mại 5% lắc mẫu trong vòng 5 phút (đối chứng).

- CT2: dung dịch hỗn hợp nano bạc–đồng 100 ppm.

- CT3: dung dịch hỗn hợp nano bạc–đồng 150 ppm.

- CT4: dung dịch hỗn hợp nano bạc–đồng 200 ppm.

- CT5: dung dịch hỗn hợp nano bạc–đồng 250 ppm.

(CT2, CT3,CT4, CT5 thực hiện trong 1 giờ, cú 15 phút lắc một lần).

Mẫu được theo dõi ở thời điểm sau 2, 3, 4 tuần ni cấy, các thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần tiên tiếp, mỗi cơng thức thí nghiệm 20 mẫu.

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sạch, tỷ lệ mẫu sống.

 Thí nghiệm 1.2: Ảnh hưởng của thời gian xử lý hỗn hợp nano bạc-đồng đến

hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp.

Sử dụng nồng độ hỗn hợp nano tốt nhất ở thí nghiệm 1.1 và xử lý ở 5 thời gian khác nhau là (30, 45, 60, 75, 90 phút) tương ứng với 5 công thức.

Mẫu được theo dõi ở thời điểm sau 2, 3, 4 tuần ni cấy, các thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần liên tiếp, mỗi cơng thức thí nghiệm 20 mẫu.

3.5.3.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA và nano bạc đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp

 Thí nghiệm 2.1: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA đến khả năng

tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp.

Đoạn thân mang mắt ngủ sau khi được khử trùng ở nồng độ và thời gian hỗn hợp nano bạc -đồng thích hợp nhất ở thí nghiệm (3.5.3.1.) được dùng để tái sinh chồi.

Chất điều tiết sinh trưởng BA được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với 5 công thức tương ứng như sau:

CT1: MS + 0,05 mg/l -NAA + 30 g/l sucrose + 0,0 mg/l BA. CT2: MS + 0,05 mg/l -NAA + 30 g/l sucrose + 1,0 mg/l BA. CT3: MS + 0,05 mg/l -NAA + 30 g/l sucrose + 1,5 mg/l BA. CT4: MS + 0,05 mg/l -NAA + 30 g/l sucrose + 2,0 mg/l BA. CT5: MS + 0,05 mg/l -NAA + 30 g/l sucrose + 2,5 mg/l BA.

Thí nghiệm được bố trí gồm 5 cơng thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu.

Mẫu được đánh giá sau 2, 3,4 tuần trên môi trường nuôi cấy.

Chỉ tiêu theo dõi:Tỷ lệ tái sinh chồi (%), hệ số nhân chồi (lần), chiều cao trung bình của chồi (cm), số lá/chồi.

Sau khi xử lý số liệu thu được sẽ tìm được cơng thức với nồng độ BA thích hợp nhất (M1) cho sự tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ.

 Thí nghiệm 2.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến khả năng tái sinh chồi từ

đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp.

Sau khi tìm được mơi trường có nồng độ BA thích hợp nhất cho bật chồi hoa hồng Pháp là M1, chúng tôi tiếp tục bố trí thí nghiệm để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano bạc được bổ sung vào môi trường M1 đến sự tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ với các nồng độ nano bạc tương ứng như sau:

CT1: M1 + 0 ppm NS. CT2: M1 + 2 ppm NS. CT3: M1 + 4 ppm NS. CT4: M1 + 6 ppm NS.

CT5: M1 + 8 ppm NS.

Thí nghiệm được bố trí gồm 5 cơng thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu.

Mẫu được đánh giá sau 2, 3, 4 tuần trên môi trường nuôi cấy.

Chỉ tiêu theo dõi:Tỷ lệ tái sinh chồi (%), hệ số nhân chồi (lần), chiều cao trung bình của chồi (cm), số lá/chồi.

3.5.3.3.. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng IBA và nano bạc đến q trình tạo mơ sẹo (callus) hoa hồng Pháp.

 Thí nghiệm 3.1: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng IBA đến quá trình

tạo mô sẹo (callus) hoa hồng Pháp.

Để nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng hình thành mơ sẹo của

mẫu lá cây hoa hồng in vitro, lá mầm in vitro có kích thước khoảng 0,5 cm-1,5

cm được cắt bỏ răng cưa và tạo vết thương được đưa vào mơi trường tạo callus được bố trí với 5 nồng độ IBA khác nhau tương ứng 5 CT như sau:

CT1: MS + 30g/l sucrose + 0,0 mg/l IBA. CT2: MS + 30g/l sucrose + 0,1 mg/l IBA. CT3: MS + 30g/l sucrose + 0,3 mg/l IBA. CT4: MS + 30g/l sucrose + 0,5 mg/l IBA. CT5: MS + 30g/l sucrose + 0,7 mg/l IBA.

Thí nghiệm được bố trí gồm 5 cơng thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu.

Đánh giá mẫu sau 4, 5, 6 tuần trên môi trường nuôi cấy để xác định chỉ tiêu: Tỷ lệ mẫu tạo callus.

Sau khi có kết quả, chúng tơi tìm ra cơng thức phù hợp nhất (M2) cho q trình tạo mơ sẹo từ lá in vitro.

 Thí nghiệm 3.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến q trình tạo mơ sẹo

(callus) hoa hồng Pháp.

Sau khi tìm được mơi trường bổ sung BA phù hợp nhất cho quá trình tạo mơ sẹo hoa hồng Pháp là M2, chúng tơi tiếp tục bố trí thí nghiệm để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano được bổ sung vào mơi trường M2 đến q trình tạo mơ sẹo với các nồng độ nano như sau:

CT1: M2 + 0 ppm NS. CT2: M2 + 2 ppm NS. CT3: M2 + 4 ppm NS. CT4: M2 + 6 ppm NS. CT5: M2 + 8 ppm NS.

Thí nghiệm được bố trí gồm 5 cơng thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu.

Đánh giá mẫu sau 4, 5, 6 tuần trên môi trường nuôi cấy để xác định chỉ tiêu: Tỷ lệ tạo callus.

3.5.3.4. Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA và nano bạc đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp

Thí nghiệm 4.1: Ảnh hưởng của của chất điều tiết sinh trưởng BA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp.

Chồi được bật ra từ mắt ngủ có chiều dài khoảng 1,5 - 2,0 cm, số lá là 3–4 lá được cắt ra và nuôi trong môi trường tái sinh chồi in vitro có bổ sung BA với các nồng độ khác nhau tương ứng 5 CT như sau:

CT1: MS + 30 g/l sucrose + 0,0 mg/l BA. CT2: MS + 30 g/l sucrose + 0,5 mg/l BA. CT3: MS + 30 g/l sucrose + 1,0 mg/l BA. CT4: MS + 30 g/l sucrose + 1,5 mg/l BA. CT5: MS + 30 g/l sucrose + 2,0 mg/l BA.

Thí nghiệm được bố trí gồm 5 cơng thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu.

Chỉ tiêu theo dõi: Đánh giá mẫu sau 2, 3, 4, 5, 6 tuần nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy để xác định các chỉ tiêu: Hệ số nhân chồi (lần), chiều cao trung bình của chồi (cm), số lá/chồi.

Sau khi xử lý số liệu, chúng tơi tìm được ra cơng thức thích hợp nhất (M3) cho q trình tái sinh chồi in vitro.

Thí nghiệm 4.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp.

nhân chồi in vitro hoa hồng Pháp là M3, em tiếp tục bố trí thí nghiệm để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano được bổ sung vào mơi trường M3 đến q trình nhân chồi in vitro hoa hồng Pháp với các nồng độ nano như sau:

CT1: M3 + 0 ppm NS. CT2: M3 + 2 ppm NS. CT3: M3 + 4 ppm NS. CT4: M3 + 6 ppm NS. CT5: M3 + 8 ppm NS.

Thí nghiệm được bố trí gồm 5 cơng thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu.

Chỉ tiêu theo dõi: Đánh giá mẫu sau 2, 3, 4, 5, 6 tuần nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy để xác định các chỉ tiêu: Hệ số nhân chồi (lần), chiều cao trung bình của chồi (cm), số lá/chồi.

3.5.3.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng -NAA và nano

bạc đến sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp

 Thí nghiệm 5.1: Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng -NAA đến sự ra

rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp.

Chồi bật ra từ mắt ngủ được chuyển sang môi trường nhân nhanh, sau 6 tuần cắt các chồi chuyển sang ni trong mơi trường ra rễ có bổ sung -NAA với các nồng độ khác nhau tương ứng 5 CT như sau:

CT1: ¼ MS + 1g/l than hoạt tính + 0mg/l -NAA. CT2: ¼ MS + 1g/l than hoạt tính + 1mg/l -NAA. CT3: ¼ MS + 1g/l than hoạt tính + 2mg/l -NAA. CT4: ¼ MS + 1g/l than hoạt tính + 3mg/l -NAA. CT5: ¼ MS + 1g/l than hoạt tính + 4mg/l -NAA.

Thí nghiệm được bố trí gồm 5 cơng thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu theo dõi sự phát triển ra rễ sau 4, 5, 6 tuần.

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ chồi ra rễ, chiều cao trung bình của rễ (cm), số rễ/chồi.

Sau khi xử lý kết quả thu được sẽ tìm được mơi trường có nồng độ -

 Thí nghiệm 5.2: Ảnh hưởng nano bạc đến sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp

Sau khi tìm được mơi trường có nồng độ -NAA thích hợp nhất, em tiếp tục bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano bạc được bổ sung vào môi trường M4 tới sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp với các công thức như sau: CT1: M4 + 0 ppm NS. CT2: M4 + 2 ppm NS. CT3: M4 + 4 ppm NS. CT4: M4 + 6 ppm NS. CT5: M4 + 8 ppm NS.

Thí nghiệm được bố trí gồm 5 cơng thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu theo dõi sư phát triển ra rễ sau 4, 5, 6 tuần.

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ chồi ra rễ, chiều cao trung bình của rễ (cm), số rễ/chồi.

3.5.4. Phân tích số liệu

- Các số liệu được xử lý thô trên Microsoft Office Excel 2007.

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHỬ TRÙNG MẪU HOA HỒNG PHÁP CỦA HỖN HỢP DUNG DỊCH NANO BẠC-ĐỒNG CỦA HỖN HỢP DUNG DỊCH NANO BẠC-ĐỒNG

4.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp nano bạc-đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp trùng mẫu hoa hồng Pháp

Để đánh giá khả năng khử trùng mẫu của dung dịch nano bạc–đồng khác nhau, các đoạn thân mang mắt ngủ được lắc trong hỗn hợp nano tương ứng (0, 100, 150, 200, 250 ppm) trong 60 phút. Công thức 1(CT1- ĐC) sử dụng dung dịch javen 5% làm đối chứng. Sau 4 tuần theo dõi thu được kết quả thể hiện ở bảng 4.1.

Bảng 4.1. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp nano bạc-đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp (sau 4 tuần)

CT NS/NC (ppm) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu sạch (%) Tỷ lệ mẫu sống sạch (%) CT1 ĐC 80,00±0,40a 20,00± 0,40d 20,00±0,40e CT2 100 65,00±0,47b 35,00±0,47c 35,00±0,47d CT3 150 51,67±0,50c 48,33±0,50b 48,33±0,50c CT4 200 10,00±0,30d 90,00±0,30a 90,00±0,30a CT5 250 5,00±0,22d 95,00±0,22a 70,00±0,47b LSD0,05 6,4 6,4 9,0 CV% 4,0 3,0 4,7

Ghi chú: So sánh các giá trị trong cùng một cột, các giá trị cơng thức mang cùng một chữ cái thì khác nhau khơng có ý nghĩa, các giá trị cơng thức mang khác chữ thì khác có ý nghĩa ở mức α = 0, 05.

Từ kết quả thu được ở bảng 4.1 cho thấy, hỗn hợp nano bạc-đồng có khả năng khử trùng vào mẫu ở tất cả nồng độ sử dụng, tỉ lệ mẫu sống sạch dao động từ 35% đến 90%; đặc biệt cơng thức 4 (200 ppm) có tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ mẫu sống sạch đều là 90%. Tỷ lệ này cao hơn rất nhiều so với công thức đối chứng sử dụng Javen 5% (20%). Ở công thức 5 (250 ppm) mặc dù cho tỷ lệ mẫu sạch đạt 95%, khơng sai có ý nghĩa về mặt thống kê với cơng thức 4 (90%). Tuy nhiên ở công thức này tỷ lệ mẫu sống sạch chỉ đạt 70% trong khi đó ở cơng thức 4 tỷ lệ

sống là 90%. Sở dĩ có kết quả như vậy, theo chúng tơi khi nồng độ nano tăng thì khả năng diệt khuẩn và nấm cũng tăng lên nhưng lại ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây, ức chế cây, do đó tỷ lệ mẫu chết tăng lên tỷ lệ mẫu sống sạch giảm đi chỉ còn 70%.

Như vậy, ở nồng độ hỗn hợp nano bạc-đồng là 200 ppm có tỷ lệ mẫu sống sạch cao nhất, đây là nồng độ hỗn hợp nano thích hợp nhất để khử trùng mẫu

hoa hồng Pháp. Kết quả này cũng tương tự với kết quả của Saber Shokri et al.

(2014), nhóm tác giả đã sử dụng đối tượng là hoa hồng Rosa hybrida L, khi khử trùng chồi mang mắt ngủ bằng nano bạc ở nồng độ 200 ppm cho tỷ lệ mẫu sạch là 80% và tỷ lệ mẫu sống trong tổng số mẫu sạch là 90%, còn ở nồng độ nano cao hơn cho tỷ lệ mẫu sạch là 90% nhưng tỷ lệ mẫu sống giảm (75%). Một số tác giả khác như Masond Fakhrfeshani et al. (2012) khi làm thí nghiệm trên mẫu cây hoa nghệ tây cũng cho thấy tỷ lệ mẫu sạch cao nhất là 89,1% khi ngâm mẫu ở dung dịch nano 200 ppm trong 1 giờ. Tuy nhiên, kết quả của A.A. Rostami và A. Shahsavar (2013) khi nghiên cứu khử trùng mắt ngủ cây Oliu, cành được cắt nhỏ, loại bỏ lá, chúng chỉ cần được ngâm trong dung dịch nano 100 ppm với thời gian 1 giờ đã cho hiệu quả khử trùng mẫu cao nhất. Vậy với mỗi loại cây trồng khác nhau thì nồng độ chế phẩm nano có khả năng khử trùng mẫu khác nhau.

Tóm lại, việc sử dụng nano bạc và đồng ở nồng độ 200 ppm trong thời gian là 60 phút là nồng độ và thời gian thích hợp nhất để khử trùng mẫu từ đoạn thân mang mắt ngủ của hoa hồng Pháp.Việc dùng chế phẩm nano không gây ô nhiễm môi trường, không gây độc hại cho người và các sinh vật khác vì thế có thể dùng hỗn hợp nano này để khử trùng mẫu thay thế cho dùng các hố chất độc hại và gây ơ nhiễm môi trường khác như HgCl2…

4.1.2. Ảnh hưởng của thời gian xử lý nano bạc-đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp mẫu hoa hồng Pháp

Để xác định thời gian sử dụng hỗn hợp nano bạc-đồng thích hợp nhất cho việc khử trùng đoạn thân mang mắt ngủ của hoa hồng Pháp, chúng tôi lựa chọn hỗn hợp nano 200 ppm (kết quả của thí ngiệm 1.1) để xử lý mẫu với 5 thời gian xử lý khác nhau là 30, 45, 60, 75, 90 phút. Sau 4 tuần theo dõi thu được kết quả trình bày ở bảng 4.2.

Bảng 4.2. Ảnh hưởng của thời gian xử lí hợp nano bạc -đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp (sau 4 tuần)

Công thức Thờigian (phút) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu sạch (%) Tỷ lệ mẫu sống sạch (%) CT1 30 56,67±0,50a 43,33±0,50c 43,33±0,50d CT2 45 45,00±0,50b 55,00±0,50b 55,00±0,50c CT3 60 10,00±0,30c 90,00±0,30a 90,00±0,30a CT4 75 8,33±0,28c 91,67±0,28a 83,33±0,38a CT5 90 6,67±0,25c 93,33±0,25a 71,67±0,45b LSD0,05 9,0 9,0 9,0 CV% 4,5 3,2 3,5