3.3.1. Vật liệu nghiên cứu
- Bọ trĩ hại cây họ cà (cà bát, cà pháo và cà tím) và cây họ bầu bí (dưa chuột, mướp và bí ngô);
- Cây đậu cô ve Phaseolus vulgaris L. dùng nuôi bọ trĩ; - Phấn hoa Typha latifolia.
3.3.2. Đối tượng nghiên cứu
- Nhện bắt mồi họ Phytoseiidae ăn bọ trĩ trên cây họ cà và bầu bí; - Nhện bắt mồi Amblyseius largoensis.
3.3.3. Dụng cụ nghiên cứu
- Dụng cụ thu thập mẫu: Túi ni lông, bút để ghi mẫu, kéo, túi díp, tấm nhựa xanh, mút, hợp nhựa, lam kính, lamen, panh, dung dịch Hoyer, sổ và bút ghi chép số liệu, kính lúp tay;
- Dụng cụ nuôi sinh học: lồng nuôi mica munger cell; tủ định ôn BIOBASE BGPX - 250, kính hiển vi soi nổi STECH, tủ lạnh National NR-B22A1.
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Điều tra, xác định thành phần, mức độ phổ biến của nhện bắt mồi họ Phytoseiidae ăn bọ trĩ hại rau họ cà và bầu bí tại Gia Lâm, Hà Nội;
- Điều tra diễn biến mật độ nhện bắt mồi Amblyseius largoensis (Muma) và bọ trĩ trên cây dưa chuột tại Gia Lâm, Hà Nội vụ Xuân Hè năm 2018;
- Nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái và sức tăng quần thể của nhện bắt mồi A. largoensis ăn phấn hoa Typha latifolia và bọ trĩ Frankliniella occidentalis
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp điều tra thành phần, mật độ của bọ trĩ và nhện bắt mồi
3.5.1.1. Điều tra thành phần nhện bắt mồi họ Phytoseidae của nhóm bọ trĩ
Điều tra 10 điểm chéo góc, mỗi điểm thu thập 10 lá ở 3 tầng, 4 hướng. Ghi nhận sự xuất hiện của NBM ăn bọ trĩ hại sau mỗi đợt điều tra.
Xác định mức độ phổ biến của bọ trĩ hại và NBM theo công thức: C% = p x 100% /P
Trong đó: p là số điểm bắt gặp. P là tổng số điểm điều tra. Ghi chú: + ít xuất hiện (<25%).
++ xuất hiện trung bình (25%-51%). +++ xuất hiện phổ biến (51%-75%). ++++ xuất hiện rất phổ biến (75%-100%).
3.5.1.2. Phương pháp làm mẫu lam
Chuẩn bị lam kính và la men sạch. Nhỏ 1 giọt dung dịch hoyer lên lam kính sau đó gắp 4-5 con NBM trưởng thành cái vào trong dung dịch hoyer. Tiếp đó soi dưới kính hiện vi, dùng kim nhọn chỉnh các đôi chân cho hiện rõ ra ngoài. Sau đó dùng panh kẹp la men đặt nhẹ nhàng lên dung dịch hoyer để hạn chế bọt khí ở trên lam kính. Tiếp theo là viết thông tin cần biết lên giấy dán giá rồi dán lên lam kính. Sau đó đặt mẫu lam đã làm vào tủ sấy 50°C trong vòng 5-6 ngày.
3.5.1.3 Điều tra mật độ bọ trĩ và nhện bắt mồi
Phương pháp điều tra thành phần và tần xuất xuất hiện của nhện bắt mồi được tiến hành theo QCVN 01-38: 2010/BNNPTNT. Điều tra thành phần nhện bắt mồi trên các cây ký chủ của bọ trĩ Frankliniella occidentalis trên dưa chuột theo định kỳ 7 ngày/ lần. Trên ruộng cây trồng điều tra, điều tra theo 10 điểm ngẫu nhiên nằm trên đường chéo của khu vực điều tra, mỗi điểm lấy ngẫu nhiên 10 lá cho vào túi nilon đóng kín và kiểm tra dưới kính hiển vi soi nổi trong phòng thí nghiệm. Điểm điều tra phải cách bờ ít nhất 1 luống hoặc hàng. Mẫu nhện bắt mồi thu được được tiến hành làm mẫu lam và giám định mẫu theo sách phân loại của Wu et al., 1997.
Mật độ (con/lá) = tổng số nhện điều tra (lá) . tổng số lá điều tra (lá)
3.5.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học nhện bắt mồi
3.5.2.1. Phương pháp nuôi nguồn bọ trĩ
Trước khi tiến hành nuôi nguồn nhện bắt mồi, nguồn bọ trĩ được nuôi trên cây đậu cove. Nguồn bọ trĩ ban đầu được thu trên cây dưa chuột tại Văn Đức, Gia Lâm, Hà Nội. Chuẩn bị đất tơi xốp có bón đầy đủ chất dinh dưỡng NPK, và chuẩn bị khoảng 10 bầu nilon có đường kính 20cm, cho đất vào bầu nilonvà tưới đất cho đủ ẩm. Ngâm hạt đậu cove trong vòng 1-2h rồi gieo hạt đậu cove vào bầu đất, trung bình 4-5 hạt trên 1 bầu đất. Tiến hành chăm sóc cho cây đậu sau khi cây có 3 lá thật thì sẽ mang vào trong lồng kín (xung quanh được bao phủ bởi kính và tầm mica được đục lỗ nhỏ để ngăn bọ trĩ bay ra ngoài và ngăn các loài côn trùng khác bay ra ngoài). Sau đó lấy nguồn bọ trĩ từ ngoài đồng ruộng thả vào lồng kín để nuôi bọ trĩ. Cứ 2 ngày thêm phấn hoa của ong vào lồng cho bọ trĩ ăn thêm. Cho lá dưa chuột, đậu cove có quấn bông thấm nước ở cuống vào lồng, sau 2 ngày lấy ra cho vào hộp giữ ẩm, sau 1-2 ngày ta thu được bọ trĩ non trên lá. Cách 5-7 ngày lại gieo đậu cove để đảm bảo có đủ cây giúp nuôi nguồn bọ trĩ.
3.5.2.2. Phương pháp nuôi nguồn nhện bắt mồi
Hình 3.1. Hộp nuôi nguồn nhện bắt mồi A. largoensis
Nguồn nhện bắt mồi A. largoensis được thu bắt ngoài ruộng dưa chuột tại Văn Đức, Gia Lâm, Hà Nội. Nhện bắt mồi được nuôi tại nhiệt độ phòng trên tấm nhựa xanh kích thước (10 x 10 x 0.3 cm) (Multicel, SEDPA, Pháp) đặt trên một
tấm mút dày 1cm đặt trong hộp nhựa trong kích thước 17 x 11 x 5 cm chứa nước. Các cạnh của tấm nhựa được phủ bởi các băng giấy ăn nhằm cung cấp nước uống cho NBM và ngăn NBM chạy trốn. Một sợi chỉ đen nhỏ được cho vào ô nuôi để làm giá thể cho NBM đẻ trứng. Hai ngày một lần trứng được thu và chuyển sang hộp nuôi mới. Nhện hại kho Carpoglyphus lactis và thức ăn được cho vào ô nuôi làm thức ăn cho NBM. Khi thấy số lượng nhện hại kho gần hết cần bổ sung để đảm bảo thức ăn dư thừa cho nhện bắt mồi.
3.5.2.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học
Để nghiên cứu đặc điểm sinh vật học của cá thể NBM, tôi sử dụng lồng nuôi NBM. Mỗi lồng nuôi gồm ba miếng mica trong suốt kích thước 40x40mm. Tấm mica dưới cùng màu đen dày 2 mm chính giữa có một lỗ tròn đường kính 1 mm tại trung tâm. Tấm mica giữa màu đen dày 5 mm với một lỗ tròn đường kính 18 mm ở trung tâm, và tấm mica trên cùng màu trắng với lỗ tròn đường kính 20mm. Tấm bóng kính trong suốt kích thước 40x40mm trên có các lỗ nhỏ (dưới 0,1 mm) được đặt giữa tấm mica giữa và trên cùng giúp không khí lưu thông trong và ngoài lồng nuôi và đủ nhỏ để nhện bắt mồi không thể chui ra ngoài. Giấy ăn được quấn lại thành sợi một đầu cắm vào lỗ nhỏ trên tấm mica dưới cùng một đầu nhúng vào nước để cung cấp nước cho nhện bắt mồi. Một kẹp giấy được sử dụng để giữ chặt các tấm mica với nhau. Các lồng nuôi được đặt trên một khay nhựa chứa nước.
Hình 3.2. Lồng mica dùng nuôi cá thể nhện bắt mồi
Trứng nhện bắt mồi (dưới 8 giờ tuổi) được cho từng quả vào trong lồng nuôi nhện. Nhện non sau khi nở được cho ăn phấn hoa T. latifolia và bọ trĩ tuổi nhỏ. Phấn hoa T. latifolia được nhập khẩu từ công ty Koppert, Hà Lan và bảo
quản trong ngăn đá tủ lạnh. Thức ăn được thêm vào lồng nuôi 2 ngày 1 lần. Vệ sinh lồng nuôi thường xuyên. Sau khi nhện hóa trưởng thành, các cá thể cái và đực được ghép đôi và cho đẻ trứng. Trứng được thu hàng ngày và tất cả trứng của các cá thể cái cùng một tuổi được chuyển vào lồng nuôi với thức ăn tương tự thức ăn của trưởng thành cái để xác định tỷ lệ đực cái của thế thệ thứ 2. Nhện được quan sát mỗi ngày một lần để xác định thời gian phát dục các pha, thời gian tiền đẻ trứng, số lượng trứng đẻ và tuổi thọ của trưởng thành cái. Các thí nghiệm được làm trong phòng tủ định ôn tại nhiệt độ 20 oC và 25oC.
3.5.2.4. Phương pháp đo kích thước NBM
Các pha phát dục NBM A. largoensis được chụp bằng kính hiển vi soi nổi có gắn camera tại phòng Bio-Control, Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Ảnh các pha phát dục NBM được chuyển sang máy vi tính và đo kích thước (chiều dài và chiều rộng) bằng phần mềm AxioVision Rel. 4.8. Số cá thể đo ở mỗi pha là 15 cá thể.
3.5.2.5. Phương pháp xử lý và tính toán số liệu
Các chỉ tiêu theo dõi
+ Kích thước trung bình của cơ thể: =
X1+X2+……….+Xn N
X1, X2..., Xn : kích thước của từng cá thể (mm) N: Tổng số cá thể theo dõi
+ Thời gian phát dục của một cá thể:
Trong đó: : Thời gian phát dục trung bình xi: Thời gian phát dục ở ngày thứ i ni: Số cá thể phát dục ở ngày thứ i N: Tổng số cá thể theo dõi + Khả năng đẻ trứng trung bình X N n . X X N 1 i i i X
=
X1+X2+……….+Xn N
Trong đó : X1, X2..., Xn số trứng đẻ của từng cá thể (qủa) N: Tổng số cá thể theo dõi (con)
+Tính tỷ lệ trứng nở
Tỷ lệ nở (%) = tổng số trứng theo dõi x 100 Số trứng nở + Xác định tỷ lệ cái
Tỷ lệ cái = Số cá thể cái
Tổng số cá thể
Phương pháp tính tỷ lệ tăng tự nhiên NBM
Khả năng phát triển quần thể của các loài nhện được đánh giá thông qua tổng hợp của một loạt các yếu tố bao gồm tốc độ phát triển, khả năng sinh sản, tỷ lệ đực cái và tỷ lệ sống sót của con cái trong một môi trường nào đó. Ở đây là môi trường không hạn chế về không gian, thức ăn dư thừa, không có ảnh hưởng của cá thể khác hoặc kẻ thù tự nhiên. Với môi trường tối ưu này, khả năng tăng quần thể là cao nhất, được đặc trưng bởi một trị số quan trọng là tỷ lệ tăng tự nhiên. Trị số này cũng được gọi là chỉ số môi trường.
+ Chỉ số môi trường này được tính theo công thức: DN r.N = DT DN: Số lượng quần thể gia tăng trong thời gian dt N: Số lượng quần thể ban đầu
DT: Thời gian tăng đôi quần thể với DT = ln(2)/rm Hay r = b - d, trong đó: b: Tỷ lệ sinh
d: Tỷ lệ chết
Hoặc dạng: Nt = No.e-rt = 1 (1)
Để tính được (1) phải lập được bảng sống, do đó cần có các thông số lx và mx - lx: tỷ lệ sống sót qua các tuổi x, là xác suất sống sót của các cá thể cái ở tuổi x - mx: Số con cái sống sót trung bình được một cá thể mẹ ở tuổi x đẻ ra trong
một đơn vị thời gian
Tổng số con cái sinh ra sống sót trong một thế hệ (do một mẹ đẻ ra) là hệ số nhân của một thế hệ: Ro = ∑ lx.mx (2)
Thời gian của một thế hệ : Tc và T là tuổi trung bình của tất cả các cá thể mẹ khi đẻ con cái
Tc = ∑ x.lx.mx (3)
Ro
T = x.lx.mx.e-rx (4) (Brich (1948), Pielou (1977))
Tc được tính theo cơ sở mẹ còn T được tính theo con mới sinh.
Lấy logarit nghịch cơ số e của r được giá trị λ là giới hạn tăng tự nhiên. Nó cho chúng ta biết số lần chủng quần tăng trong một đơn vị thời gian:
λ = antiloger (5)
Tính r, λ, Ro, Tc, T, DT thông qua phần mềm Microsoft Excel.
Tất cả số liệu được xử lý thống kê trên excel và phần mềm SPSS phiên bản 20. Số liệu được kiểm tra phân bố chuẩn dựa trên kiểm định Kolmogorov– Smirnov. Khi số liệu không phải phân bố chuẩn kiểm định Kruskal Wallis được dùng để xác định sự sai khác giữa 2 loại thức ăn và 2 mức nhiệt độ. Nếu sự sai khác là rõ rệt, kiểm định Mann-Whitney U sẽ được tiếp tục tiến hành để xác định chính xác sai khác giữa mỗi cặp thức ăn và nhiệt độ. Trong trường hợp phân bố chuẩn, kiểm định One Way ANOVA được sử dụng. Với so sánh tỷ lệ cái ở thế hệ thứ 2, Generalized linear model được sử dụng với số liệu được nhập theo dạng nhị phân, 1 ứng với cá thể cái và 0 ứng với cá thể đực. Trong tất cả các kiểm định giá trị P nhỏ hơn hoặc bằng 0,05 chứng tỏ sai khác có ý nghĩa. Để xác định mối tương tác giữa yếu tố nhiệt độ và thức ăn của một số chỉ tiêu chính như thời gian phát dục trước trưởng thành của nhện đực và nhện cái; thời gian đẻ trứng; số trứng đẻ hàng ngày, tổng số trứng đẻ và tỷ lệ tăng tự nhiên kiểm định ANOVA hai nhân tố (Two Ways Anova) được tiến hành.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. ĐIỀU TRA THÀNH PHẦN NHỆN BẮT MỒI HỌ PHYTOSEIIDAE
Để thu được nguồn nhện bắt mồi, cần tiến hành điều tra thành phần nhện bắt mồi trên đồng ruộng. Tất cả các loài nhện bắt mồi thu bắt đều thuộc họ Phytoseiidae, bộ Acari. Việc điều tra thành phần NBM là việc đầu tiên phải tiến hành vì thành phần nhện bắt mồi ngoài tự nhiên rất đa dạng.
Tôi tiến hành điều tra và thu thập nhện bắt mồi họ Phytoseiidae ở khu vực Gia Lâm – Hà Nội trên cây họ cà (cà tím, cà pháo, cà bát) và cây họ bầu bí (dưa chuột, mướp, bí ngô) năm 2017 – 2018 (Hình 4.1, 4.2, 4.3).
Hình 4.1. Ruộng cà tím tại xã Văn Đức, Gia Lâm, Hà Nội
Bảng 4.1. Thành phần nhện bắt mồi bọ trĩ họ Phytoseiidae trên cây họ cà năm 2017-2018 tại Gia Lâm – Hà Nội
TT Loài NBM Cây trồng Địa điểm Mức độ phổ
biến
1
Paraphytoseius
multidentatus Swirski & Schechter
Cà pháo, cà bát
Cổ Bi, Kim Sơn,
Kiêu Kỵ, Phú Thị +++
2 Amblyseius sp. Cà tím Văn Đức + 3 Proprioseiopsis lenis
Corpuz & Rimando Cà tím Văn Đức +
Ghi chú: + ít xuất hiện (<25%); ++ xuất hiện trung bình (25%-51%); +++ xuất hiện phổ biến (51%-75%); ++++ xuất hiện rất phổ biến (75%-100%).
Trên cà pháo, cà bát và cà tím tại 5 địa điểm thuộc huyện Gia Lâm, tôi thu thập và xác định được 3 loại nhện bắt mồi ăn bọ trĩ thuộc họ Phytoseiidae (Bảng 4.1). Trong đó loài P. multidentatus xuất hiện phổ biến trên cà pháo và cà bát tại Cổ Bi, Kim Sơn, Kiêu Kỵ và Phú Thị, tuy nhiên tại Văn Đức trên cà tím loài này không xuất hiện thay vào đó là 2 loài Amblyseius sp. và P. lenis. Tại các địa điểm điều tra nhện bắt mồi P. multidentatus xuất hiện phổ biến trên cà pháo hơn trên cà bát.
Hình 4.2. Ruộng cà pháo ở xã Phú Thị, Gia Lâm, Hà Nội
Bảng 4.2. Thành phần nhện bắt mồi bọ trĩ họ Phytoseiidae trên cây họ bầu bí năm 2017-2018 tại Gia Lâm – Hà Nội
TT Loài NBM Cây trồng Địa điểm Mức độ phổ biến
1 Amblyseius largoensis (Muma) Dưa chuột, mướp Văn Đức, Cổ Bi, Kim Sơn + 2 Euseius ovalis (Evans) Dưa chuột, bí ngô Văn Đức, Cổ Bi +
3 Paraphytoseius multidentatus Swirski & Schechter
Dưa chuột, mướp,
bí ngô Phú Thị, Cổ Bi ++
4 Proprioseiopsis lenis (Corpuz & Rimando) Dưa chuột Kim Sơn +
Ghi chú: + ít xuất hiện (<25%); ++ xuất hiện trung bình (25%-51%); +++ xuất hiện phổ biến (51%-75%); ++++ xuất hiện rất phổ biến (75%-100%).
Trên dưa chuột, mướp, bí ngô tại 4 địa điểm thuộc huyện Gia Lâm, tôi thu thập và xác định được 4 loại nhện bắt mồi ăn bọ trĩ thuộc họ Phytoseiidae (Bảng 4.2). Trong đó, loài P. multidentatus xuất hiện trung bình trên dưa chuột, cây mướp và bí ngô tại Cổ Bi, Phú Thị. Loài Amblyseius largoensis ít xuất hiện trên cây mướp, dưa chuột tại Văn Đức, Cổ Bi, Kim Sơn. Euseius ovalis ít xuất hiện trên cây dưa chuột và bí ngô ở Văn Đức và Cổ Bi. Loài Proprioseiopsis lenis chỉ xuất hiện trên cây dưa chuột ở Kim Sơn mức độ ít. Trong đó loài Paraphytoseius multidentatus là loài phổ biến nhất, Amblyseius largoensis, Euseius ovalis và
Proprioseiopsis lenis đều có xuất hiện trên mướp và dưa chuột. Trên cây dưa chuột thu thập được nhiều thành phần NBM nhất.
Bảng 4.3. Mức độ phổ biến của một số loài nhện bắt mồi bọ trĩ họ Phytoseiidae trên cây dưa chuột năm 2017-2018 tại Gia Lâm – Hà Nội
Loài nhện Mức độ phổ biến Tháng 11/2017 Tháng 4/2018 Tháng 5/2018 Tháng 6/2018 Amblyseius largoensis ++ + + + Euseius ovalis + - - - Paraphytoseius multidentatus ++ + + + Proprioseiopsis lenis - - + +
Ghi chú: - không xuất hiện, + ít xuất hiện (<25%); ++ xuất hiện trung bình (25%-51%); +++ xuất hiện phổ biến (51%-75%); ++++ xuất hiện rất phổ biến (75%-100%).
Qua bảng 4.3, kết quả cho thấy sự xuất hiện của các loài nhện có sự khác biệt