Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học nhện bắt mồi
3.5.2.1. Phương pháp nuôi nguồn bọ trĩ
Trước khi tiến hành nuôi nguồn nhện bắt mồi, nguồn bọ trĩ được nuôi trên cây đậu cove. Nguồn bọ trĩ ban đầu được thu trên cây dưa chuột tại Văn Đức, Gia Lâm, Hà Nội. Chuẩn bị đất tơi xốp có bón đầy đủ chất dinh dưỡng NPK, và chuẩn bị khoảng 10 bầu nilon có đường kính 20cm, cho đất vào bầu nilon và tưới đất cho đủ ẩm. Ngâm hạt đậu cove trong vòng 1-2h rồi gieo hạt đậu cove vào bầu đất, trung bình 4-5 hạt trên 1 bầu đất. Tiến hành chăm sóc cho cây đậu sau khi cây có 3 lá thật thì sẽ mang vào trong lồng kín (xung quanh được bao phủ bởi kính và tầm mica được đục lỗ nhỏ để ngăn bọ trĩ bay ra ngoài và ngăn các loài cơn trùng khác bay ra ngồi). Sau đó lấy nguồn bọ trĩ từ ngồi đồng ruộng thả vào lồng kín để ni bọ trĩ. Cứ 2 ngày thêm phấn hoa của ong vào lồng cho bọ trĩ ăn thêm. Cho lá dưa chuột, đậu cove có quấn bông thấm nước ở cuống vào lồng, sau 2 ngày lấy ra cho vào hộp giữ ẩm, sau 1-2 ngày ta thu được bọ trĩ non trên lá. Cách 5-7 ngày lại gieo đậu cove để đảm bảo có đủ cây giúp nuôi nguồn bọ trĩ.
3.5.2.2. Phương pháp ni nguồn nhện bắt mồi
Hình 3.1. Hộp ni nguồn nhện bắt mồi A. largoensis
Nguồn nhện bắt mồi A. largoensis được thu bắt ngoài ruộng dưa chuột tại Văn Đức, Gia Lâm, Hà Nội. Nhện bắt mồi được ni tại nhiệt độ phịng trên tấm nhựa xanh kích thước (10 x 10 x 0.3 cm) (Multicel, SEDPA, Pháp) đặt trên một
tấm mút dày 1cm đặt trong hộp nhựa trong kích thước 17 x 11 x 5 cm chứa nước. Các cạnh của tấm nhựa được phủ bởi các băng giấy ăn nhằm cung cấp nước uống cho NBM và ngăn NBM chạy trốn. Một sợi chỉ đen nhỏ được cho vào ô nuôi để làm giá thể cho NBM đẻ trứng. Hai ngày một lần trứng được thu và chuyển sang hộp nuôi mới. Nhện hại kho Carpoglyphus lactis và thức ăn được cho vào ô nuôi làm thức ăn cho NBM. Khi thấy số lượng nhện hại kho gần hết cần bổ sung để đảm bảo thức ăn dư thừa cho nhện bắt mồi.
3.5.2.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học
Để nghiên cứu đặc điểm sinh vật học của cá thể NBM, tôi sử dụng lồng nuôi NBM. Mỗi lồng nuôi gồm ba miếng mica trong suốt kích thước 40x40mm. Tấm mica dưới cùng màu đen dày 2 mm chính giữa có một lỗ trịn đường kính 1 mm tại trung tâm. Tấm mica giữa màu đen dày 5 mm với một lỗ trịn đường kính 18 mm ở trung tâm, và tấm mica trên cùng màu trắng với lỗ tròn đường kính 20mm. Tấm bóng kính trong suốt kích thước 40x40mm trên có các lỗ nhỏ (dưới 0,1 mm) được đặt giữa tấm mica giữa và trên cùng giúp khơng khí lưu thơng trong và ngồi lồng ni và đủ nhỏ để nhện bắt mồi không thể chui ra ngoài. Giấy ăn được quấn lại thành sợi một đầu cắm vào lỗ nhỏ trên tấm mica dưới cùng một đầu nhúng vào nước để cung cấp nước cho nhện bắt mồi. Một kẹp giấy được sử dụng để giữ chặt các tấm mica với nhau. Các lồng nuôi được đặt trên một khay nhựa chứa nước.
Hình 3.2. Lồng mica dùng nuôi cá thể nhện bắt mồi
Trứng nhện bắt mồi (dưới 8 giờ tuổi) được cho từng quả vào trong lồng nuôi nhện. Nhện non sau khi nở được cho ăn phấn hoa T. latifolia và bọ trĩ tuổi nhỏ. Phấn hoa T. latifolia được nhập khẩu từ công ty Koppert, Hà Lan và bảo
quản trong ngăn đá tủ lạnh. Thức ăn được thêm vào lồng nuôi 2 ngày 1 lần. Vệ sinh lồng ni thường xun. Sau khi nhện hóa trưởng thành, các cá thể cái và đực được ghép đôi và cho đẻ trứng. Trứng được thu hàng ngày và tất cả trứng của các cá thể cái cùng một tuổi được chuyển vào lồng nuôi với thức ăn tương tự thức ăn của trưởng thành cái để xác định tỷ lệ đực cái của thế thệ thứ 2. Nhện được quan sát mỗi ngày một lần để xác định thời gian phát dục các pha, thời gian tiền đẻ trứng, số lượng trứng đẻ và tuổi thọ của trưởng thành cái. Các thí nghiệm được làm trong phịng tủ định ơn tại nhiệt độ 20 oC và 25oC.
3.5.2.4. Phương pháp đo kích thước NBM
Các pha phát dục NBM A. largoensis được chụp bằng kính hiển vi soi nổi có gắn camera tại phịng Bio-Control, Khoa Nơng học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Ảnh các pha phát dục NBM được chuyển sang máy vi tính và đo kích thước (chiều dài và chiều rộng) bằng phần mềm AxioVision Rel. 4.8. Số cá thể đo ở mỗi pha là 15 cá thể.
3.5.2.5. Phương pháp xử lý và tính tốn số liệu
Các chỉ tiêu theo dõi
+ Kích thước trung bình của cơ thể: =
X1+X2+……….+Xn N
X1, X2......, Xn : kích thước của từng cá thể (mm) N: Tổng số cá thể theo dõi
+ Thời gian phát dục của một cá thể:
Trong đó: : Thời gian phát dục trung bình xi: Thời gian phát dục ở ngày thứ i ni: Số cá thể phát dục ở ngày thứ i N: Tổng số cá thể theo dõi + Khả năng đẻ trứng trung bình X N n . X X N 1 i i i X
=
X1+X2+……….+Xn N
Trong đó : X1, X2......, Xn số trứng đẻ của từng cá thể (qủa) N: Tổng số cá thể theo dõi (con)
+Tính tỷ lệ trứng nở
Tỷ lệ nở (%) = tổng số trứng theo dõi x 100 Số trứng nở + Xác định tỷ lệ cái
Tỷ lệ cái = Số cá thể cái Tổng số cá thể
Phương pháp tính tỷ lệ tăng tự nhiên NBM
Khả năng phát triển quần thể của các loài nhện được đánh giá thông qua tổng hợp của một loạt các yếu tố bao gồm tốc độ phát triển, khả năng sinh sản, tỷ lệ đực cái và tỷ lệ sống sót của con cái trong một mơi trường nào đó. Ở đây là mơi trường khơng hạn chế về khơng gian, thức ăn dư thừa, khơng có ảnh hưởng của cá thể khác hoặc kẻ thù tự nhiên. Với môi trường tối ưu này, khả năng tăng quần thể là cao nhất, được đặc trưng bởi một trị số quan trọng là tỷ lệ tăng tự nhiên. Trị số này cũng được gọi là chỉ số môi trường.
+ Chỉ số mơi trường này được tính theo cơng thức: DN r.N = DT DN: Số lượng quần thể gia tăng trong thời gian dt N: Số lượng quần thể ban đầu
DT: Thời gian tăng đôi quần thể với DT = ln(2)/rm Hay r = b - d, trong đó: b: Tỷ lệ sinh
d: Tỷ lệ chết
Hoặc dạng: Nt = No.e-rt = 1 (1)
Để tính được (1) phải lập được bảng sống, do đó cần có các thơng số lx và mx - lx: tỷ lệ sống sót qua các tuổi x, là xác suất sống sót của các cá thể cái ở tuổi x - mx: Số con cái sống sót trung bình được một cá thể mẹ ở tuổi x đẻ ra trong
một đơn vị thời gian
Tổng số con cái sinh ra sống sót trong một thế hệ (do một mẹ đẻ ra) là hệ số nhân của một thế hệ: Ro = ∑ lx.mx (2)
Thời gian của một thế hệ : Tc và T là tuổi trung bình của tất cả các cá thể mẹ khi đẻ con cái
Tc = ∑ x.lx.mx (3)
Ro
T = x.lx.mx.e-rx (4) (Brich (1948), Pielou (1977))
Tc được tính theo cơ sở mẹ cịn T được tính theo con mới sinh.
Lấy logarit nghịch cơ số e của r được giá trị λ là giới hạn tăng tự nhiên. Nó cho chúng ta biết số lần chủng quần tăng trong một đơn vị thời gian:
λ = antiloger (5)
Tính r, λ, Ro, Tc, T, DT thông qua phần mềm Microsoft Excel.
Tất cả số liệu được xử lý thống kê trên excel và phần mềm SPSS phiên bản 20. Số liệu được kiểm tra phân bố chuẩn dựa trên kiểm định Kolmogorov– Smirnov. Khi số liệu không phải phân bố chuẩn kiểm định Kruskal Wallis được dùng để xác định sự sai khác giữa 2 loại thức ăn và 2 mức nhiệt độ. Nếu sự sai khác là rõ rệt, kiểm định Mann-Whitney U sẽ được tiếp tục tiến hành để xác định chính xác sai khác giữa mỗi cặp thức ăn và nhiệt độ. Trong trường hợp phân bố chuẩn, kiểm định One Way ANOVA được sử dụng. Với so sánh tỷ lệ cái ở thế hệ thứ 2, Generalized linear model được sử dụng với số liệu được nhập theo dạng nhị phân, 1 ứng với cá thể cái và 0 ứng với cá thể đực. Trong tất cả các kiểm định giá trị P nhỏ hơn hoặc bằng 0,05 chứng tỏ sai khác có ý nghĩa. Để xác định mối tương tác giữa yếu tố nhiệt độ và thức ăn của một số chỉ tiêu chính như thời gian phát dục trước trưởng thành của nhện đực và nhện cái; thời gian đẻ trứng; số trứng đẻ hàng ngày, tổng số trứng đẻ và tỷ lệ tăng tự nhiên kiểm định ANOVA hai nhân tố (Two Ways Anova) được tiến hành.