3.3.1. Đối tượng nghiên cứu
Trùng bào tử sợi gây bệnh trên Cá Chép tại các ao nuôi thuộc tỉnh Hải Dương.
3.3.2. Vật liệu nghiên cứu
Nghiên cứu trùng bào tử sợi trên cá chép
Bộ dụng cụ giải phẫu cá, ống falcon 50ml, cối, chày sứ và các cốc đong, micropipet, lam kính, đèn cồn.Bộ thuốc nhuộm Gram. Kính hiển vi điện.
Mẫu bào nang TBTS kí sinh ở ruột của cá chép thương phẩm và bào nang TBTS kí sinh ở mang cá chép giống cấp 1 (50g/con).
Điều trị thử nghiệm cho Cá Chép nhiễm bệnh Trùng bào tử sợi tại các ao
Tiến hành ngay tại các ao có cá chép bị bệnh TBTS (ở ruột hoặc mang) trên địa bàn Hải Dương (Bình Giang và Ninh Giang).
Thuốc điều trị được sử dụng gồm: NOVA-Parasite, HAN-DERTIL B, FASIO PHARM, PRAZIQUANTEL.
HAN – DERTIL B: thành phần của thuốc gồm Triclabendazole và Albendazole được phối hợp theo tỉ lệ 1:1.
FASIO – PHARM: thành phần của thuốc là Triclabendazole.
Các thuốc khử trùng được dùng bao gồm: VICATO, BKC 800 của ANOVA.
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Khảo sát tình hình cá Chép nghi mắc bệnh Trùng bào tử sợi tại các ao thuộc tỉnh Hải Dương.
- Xác định triệu chứng, bệnh lý của cá nghi mắc bệnh Trùng bào tử sợi. - Xác định đặc điểm hình thái của loài Trùng bào tử sợi ký sinh trong ruột cá Chép thương phẩm, trong mang cá Chép giống cấp 1 và so sánh với 2 loài tham chiếu.
- Thử nghiệm điều trị bệnh Trùng bào tử sợi trên cá Chép mắc bệnh tại các ao thuộc tỉnh Hải Dương.
3.5.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp thu mẫu và mổ khám Cá Chép
Sơ đồ các bước thực hiện
Phương pháp thu mẫu cá chép bị bệnh do trùng bào tử sợi kí sinh ở ruột:
Đối với mẫu cá chết: Với những mẫu không thể vận chuyển nguyên con về phòng thí nghiệm, tiến hành thu mẫu bào nang ngay tại ao. Cá được mổ theo 3 đường cơ bản để bộc lộ xoang bụng, sau đó tiến hành lấy bào nang trong ruột. Bào nang được lưu giữ trong chai nhựa có thể tích 500ml và để trong ngăn mát tủ lạnh bảo quản. Nếu có đủ điều kiện, mẫu cá chết sẽ được bảo quản lạnh trong
Nghiên cứu TBTS trên cá chép
Thu mẫu
Thu mẫu làm tiêu bản xác định kích thước và hình thái
Thu mẫu làm tiêu bản mô bệnh học
Đo kích thước của 30 bào tử Quan sát tổn thương do bào nang TBTS ở mang cá
thùng xốp, vận chuyển về phòng thí nghiệm bộ môn Môi trường - Bệnh thủy sản, sau đó mới tiến hành giải phẫu để thu mẫu bào nang.
Đối với mẫu cá sống: Với mẫu cá sống, tiến hành đóng cá vào túi nilong và bơm oxy, cần vận chuyển nhanh chóng về phòng thí nghiệm để tiến hành giải phẫu thu mẫu bào nang. Nếu khi vận chuyển về phòng thí nghiệm, cá vẫn còn sống thì có thể thả vào bể nhằm lưu giữ mẫu sống để sử dụng lâu dài hơn.
Số bào nang thu được, sau khi làm thí nghiệm một phần, phần còn lại sẽ được lưu giữ trong ống falcon và bảo quản ở ngăn mát hoặc ngăn đá tủ lạnh.
Phương pháp thu mẫu cá chép bị bệnh do trùng bào tử sợi kí sinh ở mang
Đối với cá chết: tiến hành thu cả con và bảo quản trong ống falcon chứa cồn Etanol 90o, sau đó vận chuyển về phòng thí nghiệm để giải phẫu lấy bào nang ở mang.
Đối với mẫu cá sống: tiến hành đóng túi nilong với mật độ thưa và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm để giải phẫu lấy bào nang.
Số cá thu được sẽ được sử dụng một phần, số cá còn lại sẽ được cho vào ống falcon và bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh để giữ mẫu.
Phương pháp làm tiêu bản
Bước 1: Bào nang được nghiền bằng cối chày sứ, sau đó sẽ được pha loãng với nước.
Bước 2: Dùng micropipet (1000µl), hút lấy dung dịch vừa pha loãng ở bước 1 và nhỏ lên lam kính. Chú ý trước khi hút nên đảo đều dung dịch.
Bước 3: Cố định mẫu trên ngọn lửa đèn cồn. Hơ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn đến khi dung dịch vừa nhỏ trên lam kính bay hơi hết. Chú ý không để lam kính quá gần ngọn lửa sẽ làm vỡ lam kính.
Bước 4: Nhuộm mẫu. Sử dụng bộ thuốc nhuộm Gram, có thể sử dụng thuốc nhuộm số 1 (Crystal violet) hoặc thuốc nhuộm số 4 (Fucsin). Hoặc nhuộm mẫu với 3 thuốc nhuộm 1,2,3.
3.5.2. Phương pháp nghiên cứu hình thái của trùng bào tử sợi
Sử dụng tiêu bản vừa làm được soi dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần. Thị kính có gắn thước trắc vi chữ thập chia vạch từ 0-10mm gồm 100 vạch nhỏ. Khi sử dụng độ phóng đại 1000 lần, mỗi vạch nhỏ tương ứng 1 .
Tiến hành quan sát hình thái của cả 2 loài TBTS kí sinh ở ruột và kí sinh ở mang cá chép.
Tiến hành đo kích thước của 30 bào tử của loài TBTS kí sinh trong ruột và 30 bào tử của loài TBTS kí sinh ở mang, nhập số liệu vào bảng tính Excel và tiến hành tính kết quả.
Từ đó so sánh về hình thái và kích thước bào tử của 2 loài TBTS nói trên.
Làm tiêu bản mô bệnh học
Mẫu cá chép giống bị bệnh TBTS ở mang (50g/con) được thu, cố định mẫu trong dung dịch Buffer formaline 10%, sau đó gửi mẫu đến bộ môn Bệnh lý thú y để làm tiêu bản mô bệnh học.
Soi tiêu bản trên kính hiển vi và chụp lại hình ảnh.
3.5.3. Phương pháp nghiên cứu triệu chứng và bệnh tích
Tiến hành chẩn đoán lâm sàng bằng các phương pháp quan sát, mổ khám thông thường, kiểm tra ruột, mang và các cơ quan khác . Căn cứ vào thông tin tại các ao nuôi, triệu chứng điển hình của bệnh gặp phải như cá nổi vật vờ, dạt vào bờ, bụng trướng to, quẫy mạnh… để đưa ra kết luận chẩn đoán.
3.5.4. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ bệnh do Trùng bào tử sợi gây ra trên cá Chép (Cyprinus Caprio) trên cá Chép (Cyprinus Caprio)
Phương pháp nghiên cứu dịch tễ được sử dụng bao gồm: dịch tễ học mô tả và dịch tễ học phân tích. Điều tra các yếu tố xoay quanh “ĐVTS (Cá Chép) – Không gian – Thời gian”.
Sử dụng phương pháp báo cáo ca bệnh (nghiên cứu từng trường hợp bệnh) trong dịch tễ học mô tả, để tìm hiểu về các dấu hiệu bệnh lý đặc trưng của cá bị TBTS. Sử dụng phương pháp nghiên cứu tương quan và điều tra ngang với 257 ao nuôi cá chép địa bàn 4 huyện Bình Giang, Cẩm Giàng, Ninh Giang, Thanh Miện. Việc khảo sát tiến hành hoàn toàn ngẫu nhiên. Tại mỗi ao nuôi, đưa ra “Bộ câu hỏi điều tra” để người nuôi trực tiếp tham gia trả lời. “Bộ câu hỏi điều tra” được gắn ở phần PHỤ LỤC.
Các tiêu chí để điều tra bao gồm: địa điểm, diện tích, số năm đưa vào sử dụng, nguồn nước cấp, việc khử trùng nước cấp, loài nuôi, có hay không có bệnh trong ao nuôi, cách phòng và điều trị bệnh.
Số liệu thu thập được sẽ nhập vào bảng tính Excel để tiến hành tổng hợp và tính toán cụ thể.
Thông tin về số ao điều tra được tại mỗi huyện được thể hiện ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Số lượng ao được khảo sát tại 4 huyện của tỉnh Hải Dương.
STT Tên huyện Số ao 1 Bình Giang 55 2 Cẩm Giàng 52 3 Ninh Giang 81 4 Thanh Miện 69 Tổng 257
3.5.5. Phương pháp điều trị thử nghiệm bệnh cho Cá Chép bị bệnh Trùng bào tử sợi tại các ao bào tử sợi tại các ao
Tiến hành điều trị thử nghiệm tại 15 ao bị bệnh TBTS kí sinh bằng 1 trong 4 phác đồ, thông tin về về 15 ao bị bệnh TBTS và 4 phác đồ điều trị được thể hiện ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Các phác đồ điều trị thử nghiệm bệnh do TBTS STT Phác đồ Thuốc điều trị Liều sử dụng (mg/kg cá) Số ngày sử dụng thuốc Số ao điều trị 1 1 NOVA-Parasite 100 2 6 2 2 HAN-DERTIL B (Triclabendazole:Albendazole) 6:6 2 6 3 3 FASIO-PHARM (Albendazole) 12 2 1 4 4 PRAZIQUANTEL 2,5 3 2
Khi bắt đầu thực hiện điều trị sẽ tiến hành ghi chép lại số liệu về ngày bắt đầu, phác đồ được áp dụng. Sau đó, thu thập kết quả điều trị gián tiếp thông qua chủ ao.
Chú ý: Ở mỗi phác đồ việc sử dụng thuốc khử trùng là giống nhau, có thể sử dụng 1 trong 2 loại thuốc khử trùng là VICATO hoặc BKC 800.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ BỆNH TRÙNG BÀO TỬ SỢI KÍ SINH Ở CÁ CHÉP CHÉP
4.1.1. Tình hình bệnh do trùng bào tử sợi kí sinh trong ruột của cá chép.
4.1.1.1. Tình hình nuôi cá chép tại các điểm nghiên cứu.
Qua điều tra 257 ao có nuôi cá Chép tại 4 huyện là Bình Giang, Cẩm Giàng, Ninh Giang và Thanh Miện của tỉnh Hải Dương, kết quả về diện tích ao nuôi, hình thức nuôi được thể hiện ở bảng 4.1. Kết quả về tỉ lệ các loài nuôi trong ao được thể hiện ở bảng 4.2.
Bảng 4.1. Diện tích và hình thức nuôi của các ao các huyện.
STT Địa điểm Số ao điều tra Diện tích trung bình của ao (m2) Hình thức nuôi
Nuôi đơn Nuôi ghép
Số ao Tỉ lệ (%) Số ao Tỉ lệ (%)
1 Bình Giang 55 2914,6 0 0 55 100
2 Cẩm Giàng 52 3156,9 0 0 52 100
3 Ninh Giang 81 3806,3 0 0 81 100
4 Thanh Miện 69 2839,8 1 1,45 68 98,55
Qua bảng 4.1 cho thấy, các ao nuôi được điều tra hầu hết đều nuôi theo hình thức nuôi ghép. Chỉ có duy nhất 1 ao tại huyện Thanh Miện nuôi theo hình thức nuôi đơn.
Bảng 4.2. Tỉ lệ của các loài cá nuôi trong ao
STT Tỉ lệ của các loài cá (%) Địa điểm Cá Trôi Cá Mè Trắm Cá Chép Cá Cá Rô phi Cá khác (Cá Trắm đen, Nheo Tàu) 1 Bình Giang 15,58 9 41,2 32,1 0 1,12 2 Cẩm Giàng 22,96 3,81 42,06 27,81 0 3,36 3 Ninh Giang 3,75 2,33 7,47 15,63 70,82 0 4 Thanh Miện 3,17 2,83 6,89 17,63 69,48 0
Qua bảng 4.2 cho thấy, các ao đều nuôi các loài nuôi truyền thống (cá Trôi, Mè, Trắm, Chép), 2 huyện Ninh Giang và Thanh Miện ngoài cá truyền thống còn nuôi cả cá Rô phi. Huyện Bình Giang và Cẩm Giàng tỉ lệ cá Chép khá lớn, lần lượt là 32,1% và 27,81%
4.1.1.2. Số ao có bệnh trùng bào tử sợi
Qua quá trình điều tra 257 ao có nuôi cá Chép thuộc 4 huyện Bình Giang, Cẩm Giàng, Ninh Giang, Thanh Miện, kết quả nghiên cứu thu được số ao có bệnh, mối liên hệ giữa nguồn gốc giống và bệnh, được thể hiện ở lầm lượt các bảng 4.6
Bảng 4.3. Số ao có cá chép bị bệnh TBTS kí sinh trong ruột
STT Địa điểm Số ao điều tra Số ao có bệnh
1 Bình Giang 55 15 2 Cẩm Giàng 52 22 3 Ninh Giang 81 26 4 Thanh Miện 69 19 5 Tổng 257 82 Tỉ lệ (%) 31,91
Qua bảng 4.3, có thể thấy trong số 257 ao có 82 ao đã có bệnh chiếm tỉ lệ 31,91% số ao được điều tra.
4.1.1.3.Diễn biến thời gian diễn ra bệnh trùng bào tử sợi kí sinh ở ruột cá Chép
Tiến hành điều tra thời gian diễn ra bệnh của 72 ao trong tổng số 82 ao có bệnh (do một số người nuôi không nhớ được thời gian có bệnh), có tổng số lần mắc là 127 lần (có 5 ao có cá chết do bệnh ở tất cả các tháng trong năm), kết quả được thể hiện ở bảng 4.4.
Bảng 4.4. Diễn biến thời gian diễn ra bệnh TBTS kí sinh ở ruột cá chép
Tháng 1-2 2-3 3-4 4-5 5-6 6-7 7-8 8-9 9-10 10-11 11-12 12-1 Tổng
Số ao bị bệnh 10 13 14 23 13 6 13 9 5 5 6 10
127
Qua bảng 4.7, cho thấy khoảng thời gian có số ao bị bệnh nhiều nhất là vào tháng 4-5 chiếm 18,11% tổng số lần có bệnh có các ao được điều tra. Khoảng thời gian có số ao mắc bệnh ít nhất là vào tháng 9-10 và 10-11 đều chiếm 3,94%. Như vậy, có thể thấy bệnh TBTS kí sinh trong ruột cá chép gây chết cá vào khoảng thời gian đầu mùa hè (do thời gian xuống giống thường là vào tháng 9-11 nên tại thời điểm tháng 4-5 theo tốc độ phát triển của cá, bào nang cũng đạt kích thước khá lớn làm cho cá bị tắc ruột chết).
4.1.1.4. Kích cỡ cá Chép chết do bị bệnh do TBTS kí sinh ở ruột cá Chép
Điều tra được 34 ao trên tổng số 82 ao mắc bệnh về trọng lượng cá chết khi bị bệnh TBTS kí sinh ở ruột. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.5.
Bảng 4.5. Trọng lượng cá chết do bị bệnh TBTS
Trọng lượng (g) <300 300-500 500-700 >=700 Tổng số ao
Số ao mắc 3 7 8 16
34
Tỉ lệ (%) 8,82 20,59 23,53 47,06
Qua bảng 4.5, cho thấy cá bị bệnh chết khi đạt trọng lượng cá lớn hơn hoặc bằng 700g là nhiều nhất chiếm 47,06%, cá dưới 300g bị bệnh có tỉ lệ chết ít nhất chiếm 8,82%. Sự phát triển của bào nang là tỉ lệ thuận với sự tăng trưởng của cá chép, sự phát triển của bào nang sẽ làm cho cá bị tắc ruột, vỡ ruột dẫn đến việc cá chết.
4.1.1.5. Mối liên hệ giữa thời gian sử dụng ao và bệnh TBTS kí sinh trong ruột cá chép.
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của thời gian đưa vào sử dụng của các ao đến sự xuất hiện bệnh TBTS STT Số năm sử dụng (năm) Tổng số ao điều tra Số ao bị bệnh Tỉ lệ ao bệnh (%) 1 1-5 62 15 24,19 2 6-10 80 23 28,75 3 11-15 24 8 33,33 4 16-20 80 33 41,25 5 >20 11 3 27,27
Thời gian sử dụng ao càng lâu thì mùn bã hữu cơ, các chất thải tích tụ là môi trường lý tưởng cho giun đáy phát triển mà theo nghiên cứu của Dandan Zhao et al. (2016) đã nghiên cứu về vòng đời của 1 loài TBTS (Thelohanellus kitauei) có liên quan đến loài giun đáy. Chính vì lí do, đề tài tiến hành điều tra thời gian đưa vào sử dụng của 257 ao và thời gian sử dụng của 82 ao bị bệnh từ đó tìm ra có hay không mối liên hệ giữa thời gian sử dụng ao và bệnh TBTS kí sinh trong ruột cá chép, kết quả được thể hiện ở bảng 4.6.
Qua bảng 4.6 có thể thấy những ao đưa vào sử dụng từ 16-20 năm có tỉ lệ bị bệnh cao nhất chiếm tới 41,25% số ao được điều tra. Những ao đưa vào sử dụng từ 1-5 năm có tỉ lệ bị bệnh thấp nhất với 24,19%. Như vậy có thể thấy, những ao có thời gian sử dụng càng dài thì khả năng có bệnh xuất hiện càng lớn. Do thời gian sử dụng lâu dài, đáy ao tích tụ nhiều chất thải là điều kiện lý tưởng cho mầm bệnh phát triển và gây bệnh cho những lứa nuôi tiếp sau.
Với những ao sử dụng trên 20 năm lại có tỉ lệ bệnh chỉ còn 27,27%, do tỉnh Hải Dương tiến hành việc chuyển đổi từ năm 1993, nên những ao có thời gian sử dụng trên 20 năm không nhiều, trong quá trình điều tra ít gặp.
4.1.1.6. Ảnh hưởng của nguồn nước cấp tới khả năng xuất hiện bệnh
Điều tra nguồn nước của 257 ao nuôi (có 57 ao nuôi dùng 2 nguồn nước khác nhau), việc khử trùng nước trước khi nuôi và số ao bị bệnh của từng nguồn nước, kết quả được thể hiện ở bảng 4.7.
Bảng 4.7. Ảnh hưởng của nguồn nước cấp đến sự xuất hiện của bệnh
STT Nguồn nước Tổng số ao theo dõi Số ao bị bệnh Tỉ lệ (%) 1 Nước sông 201 66 32,84 2 Nước giếng 92 25 27,17
3 Nguồn khác (nước mưa, nước ruộng) 21 6 28,57
Qua bảng 4.7, có thể thấy tỉ lệ ao bị bệnh khi sử dụng nguồn nước cấp là nước sông cao nhất với 32,84% số ao điều tra, tỉ lệ ao bị bệnh khi sử dụng nước giếng là nhỏ nhất với 27,17% số ao điều tra. Do sông vừa là nguồn cấp nước lại vừa là nơi chứa nước thải ra từ các ao nuôi vì vậy mầm bệnh lây lan theo nguồn nước cấp vào ao nuôi.
Theo dõi 257 ao về số ao có khử trùng và số ao không khử trùng trước khi nuôi cá, lập bảng tiếp liên 2x2 để xem xét dùng không nước khử trùng có phải là yếu tố nguy cơ dẫn đến ao có bệnh TBTS kí sinh trong ruột cá chép hay không, kết quả được trình bày ở bảng 4.8, sau đó tiến hành tính Tỷ xuất chênh (OR)