3.3.1. Nguyên liệu xét nghiệm
3.3.1.1. Nguyên liệu dùng cho phương pháp 3ABC - ELISA
- Coating buffer (Bicabonat natri), PBS (Phosphate bufferedsaline) - Dung dịch Tween 20; Sữa tách bơ, Substrate – TMB.
- Bộ CHEKIT FMD – 3ABC – BO – OV và bộ CHEKIT FMD – 3ABC – PO của Bommeli Diagnostics (Thuỵ Sĩ) để phát hiện kháng thể kháng virus LMLM ở trâu bò và lợn do nhiễm tự nhiên bao gồm:
•Đĩa ELISA 96 giếng đã được gắn kháng nguyên 3ABC kháng virus LMLM.
•Huyết thanh chuẩn làm đối chứng âm, dương.
•Dung dịch pha loãng mẫu (sample - diluent).
•Dung dịch nước rửa (concentrate).
•Conjugate.
•Dung dịch substrate – TMB.
3.3.1.2. Nguyên liệu dùng cho phương pháp Realtime RT-PCR
•Bộ kit tách chiết RNA.
•Cặp mồi (primers) và probe.
3.3.1.3. Nguyên liệu dùng cho phương pháp RT - PCR
•Bộ kit tách chiết RNA.
•Cặp mồi (primers).
•Agarose.
•Dung dịch đệm TAE (tris axetat EDTA) hoặc TBE (tris borat EDTA).
•Chất nhuộm màu, ví dụ: Sybr safe.
•Loading dye 6X (chất đệm tải mẫu).
•Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic).
•Thang chuẩn ADN (Ladder, marker).
3.3.2. Trang thiết bị dùng trong nghiên cứu
3.3.2.1. Dụng cụ lấy mẫu
- Probang – cup: Theo trung tâm nghiên cứu bệnh động vật Plum Island - đây là dụng cụ có chứa 1 cái cốc để thu thập dịch nhầy. Nếu dụng cụ lấy mẫu probang – cup không có sẵn thì mẫu tăm bông được ngoáy từ mũi hoặc miệng cũng có thể được sử dụng. Những loại mẫu bệnh phẩm này có thể được thu thập để chẩn đoán tốt trong những ca bệnh cấp tính, nhưng kém hơn trong chẩn đoán những ca bệnh ở giai đoạn mãn tính (mang trùng).
- Các loại dụng cụ lấy mẫu thông thường như: Gióng cố định gia súc, bông thấm, cồn Iode, cồn 700, bơm kim tiêm nhựa, giá và hộp đựng mẫu, ống nhựa eppendorf 2ml và 10ml có nắp đậy, thiết bị giữ lạnh (thùng đá, đá khô hoặc nitơ lỏng).
3.3.2.2. Máy móc, dụng cụ xét nghiệm phòng thí nghiệm
- Các loại dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm bao gồm: Bình tam giác các loại, ống đong các loại, pi-pét thủy tinh các loại, mi-cro-pi-pét các cỡ 1, 8, 12 kênh), đầu típ nhựa các cỡ dùng cho mi-cro-pi-pét.
- Một số máy móc cần thiết dùng cho phương pháp 3 ABC – ELISA: máy đọc ELISA, tủ ấm.
- Một số máy móc cần thiết dùng cho phương pháp PCR:
•Máy ly tâm.
•Máy lắc trộn vortex.
•Máy spindown.
•Bộ điện di, gồm bộ nguồn và bể chạy điện di.
•Máy đọc gel (blue light transilluminator).
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Điều tra tình hình chăn nuôi tại tỉnh Lạng Sơn, Phú Thọ năm 2011 – 2015. - Điều tra tình hình dịch bệnh và công tác tiêm vacxin LMLM tại Lạng Sơn, Phú Thọ năm 2011 – 2015.
- Điều tra tỷ lệ trâu bò có kháng thể tự nhiên đối với virus LMLM tại 2 tỉnh Phú Thọ và Lạng Sơn năm 2011 – 2015.
- Chẩn đoán và định type virus LMLM tại 2 tỉnh Phú Thọ và Lạng Sơn năm 2011 – 2015.
3.5. PHƯƠNG PHÁP
3.5.1. Phương pháp nghiên cứu
- Nghiên cứu hồi cứu: Nhằm thu thập, tổng hợp thông tin từ Chi cục Thú y các tỉnh, Trung tâm Chẩn đoán Thú y TW và Cục Thú y về tình hình chăn nuôi trâu bò, diễn biến bệnh LMLM, kết quả tiêm phòng vacxin LMLM cho đàn trâu bò tại tỉnh Lạng Sơn và Phú Thọ từ năm 2011 đến năm 2015.
- Nghiên cứu cắt ngang kết hợp với nghiên cứu bệnh chứng đã được tiến hành tại hai tỉnh Lạng Sơn và Phú Thọ.
3.5.2. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
- Lần 1 (nghiên cứu cắt ngang): Lấy mẫu huyết thanh của trâu bò tại các hộ chăn nuôi. Sau đó tiến hành xét nghiệm bằng phương pháp 3 ABC ELISA.
Mẫu huyết thanh: Lấy từ 4ml – 6ml máu để có thể có được 2ml huyết thanh. Sau khi lấy được máu, kéo nhẹ pittong lui về phía sau để tạo khoảng trống rồi nghiêng một góc 150 – 250 so với mắt đất và để yên trong khoảng 30 phút để cho máu đong lại trước khi di chuyển. Tách lấy huyết thanh, bảo quản mẫu huyết thanh ở 4 - 80C cho đến khi vận chuyển về phòng thí nghiệm.
- Lần 2 (nghiên cứu bệnh - chứng): Sau khi có kết quả xét nghiệm mẫu huyết thanh, lấy mẫu probang của tất cả trâu bò cho kết quả dương tính huyết
thanh học với virus LMLM bằng phương pháp 3 ABC ELISA.
Mẫu probang: Để thu thập được những mẫu probang (dịch từ hầu – họng /niêm mạc được cạo ra) thì có thể được thực hiện theo những bước sau đây:
•Sử dụng chuồng ép để cố định gia súc. Việc cố định gia súc là cần thiết
•Đưa dụng cụ lấy mẫu probang xuyên qua miệng và ở phía trên lưỡi sau đó đến hầu họng / thực quản với một lực nhẹ nhàng.
•Đưa dụng cụ vào khoảng 70 – 90% độ sâu của dụng cụ lấy mẫu probang
•Di chuyển dụng cụ với động tác nhẹ nhàng và nhanh, cạo các biểu mô thực quản, vòm miệng mềm, và thành của hầu - họng. Các vùng quan trọng nhất để thu thập mẫu là chỉ sâu hơn các sụn thanh quản.
•Nhẹ nhàng kéo dụng cụ lấy mẫu ra ngoài kèm với cốc với lực kéo ổn định. Việc này là rất quan trọng để di chuyển dụng cụ lấy mẫu probang ra ngoài nhằm tránh làm hại các mô phía trong của gia súc, chỉ cần dùng với một lực liên tục nhẹ nhàng. Tránh làm đổ dung dịch mẫu thu thập được chứa trong cốc.
•Nếu mẫu được xem là phù hợp (mẫu không chứa thức ăn), đổ dung dịch thu được từ cốc vào ống thu thập mẫu.
•Sau khi lấy, lưu giữ mẫu và vận chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ. Trong trường hợp không vận chuyển được về phòng thí nghiệm thì mẫu phải được bảo quản trong bình nitơ lỏng.
•Sát trùng dụng cụ lấy mẫu probang với thuốc sát trùng đã được chuẩn bị trước đó.
•Rửa sạch dụng cụ lấy mẫu probang sau khi đã được ngâm với thuốc sát trùng với nước để chuẩn bị lấy mẫu cho gia súc khác.
Trường hợp mẫu được lấy có chứa một vài giọt máu, thì mẫu này có thể sử dụng, tuy nhiên người thực hiện lấy mẫu nên thực hiện nhẹ nhàng hơn hoặc cân nhắc để lựa chọn 1 dụng cụ khác với đường kính của cốc nhỏ hơn. Nếu trong mẫu được lấy có chứa thức ăn được gia súc nôn ra từ dạ cỏ, (1) giữ lại mẫu này, (2) cho gia súc nghỉ ngơi trong 5 phút, và (3) thực hiện lấy mẫu lại với dụng cụ lấy mẫu probang có đường kính của cốc nhỏ hơn. Nhưng lần lấy mẫu thứ 02 mà mẫu được lấy vẫn chứa thức ăn, vẫn giữ lại mẫu, tuy nhiên cố gắng loại bỏ thức ăn từ các mẫu trên và gộp chung những mẫu dịch nhầy đã thu thập được vào trong cùng 1 ống.
Bảng 3.1. Công thức pha môi trường bảo quản mẫu Probang
Hóa chất Số lượng
MEM bột 37,6 gram
HEFES (Gibco15630) 37,5 gram
Kháng sinh 5 ml/1,5 lít
L glutamine 20 ml/2 lít
NaHCO3 35ml/2 lít
(Áp dụng cho thể tích dung dịch môi trường 04 lít)
Hình 3.1. Lấy mẫu probang
3.5.3. Phương pháp phát hiện kháng thể Lở mồm long móng do nhiễm tự nhiên bằng phương pháp 3ABC - ELISA nhiên bằng phương pháp 3ABC - ELISA
Nguyên liệu: Bộ KIT chẩn đoán PrioCHECK® FMDV NS và các dụng cụ thông thường sử dụng trong phòng thí nghiệm.
* Các bước tiến hành xét nghiệm:
- Đĩa ELISA đã có sự gắn kết giữa kháng thể đơn dòng đặc hiệu (mAb) và kháng nguyên 3ABC của virus LMLM.
- Chuẩn bị nguyên liệu:
•Dilution buffer (2X), nồng độ pha loãng 1/2: 2ml Dilution buffer (2X) và 2 ml nước khử khoáng.
•ELISA buffer, nồng độ pha loãng 1/10: 0.4ml ELISA buffer và 3.6ml Dilution buffer đã pha loãng.
•Washing solution (200X), nồng độ pha loãng 1/200: 8ml Washing solution (200X) và 1.6l nước khử khoáng.
Xét nghiệm được tiến hành như sau:
- Bước 1: Cho 80µl đã pha loãng vào tất cả các giếng.
- Bước 2: Cho 20µl đối chứng âm vào 2 giếng A1 và B1; 20 µl đối chứng dương yếu vào 2 giếng C1 và D1; 20µl đối chứng dương vào 2 giếng E1 và F1; 20µl mẫu huyết thanh trâu bò vào các giếng còn lại. Phủ kín và lắc nhẹ đĩa; ủ qua đêm ở nhiệt độ 22±30C.
- Bước 3: Loại bỏ…. sau đó rửa đĩa bằng dung dịch Washing solution đã pha loãng với lượng 300µl/giếng, đập đĩa dứt khoát sau mỗi lần rửa. Lặp lại 6 lần.
- Bước 4: Gắn conjugate, tỷ lệ 1: 30.
+ Pha loãng Conjugate: 55µl Conjugate (30x) + 2.03ml ELISA buffer đã pha loãng.
+ Cho 100µl conjugate/giếng, phủ kín đĩa và ủ ở 22±30C trong 60 phút, sau đó lặp lại bước 3.
- Bước 5: Cho 100µl Chromogen (TMB) substrate/giếng vào tất cả các giếng, ủ ở 22±30C trong 20 phút.
- Bước 6: Dừng phản ứng: Cho 100µl Stop Slution/giếng vào tất cả các giếng.
- Bước 7: Đọc kết quả phản ứng bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 450nm. - Sơ đồ đĩa như sau:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A N S3 … B N S4 C P1 S5 D P1 S6 E P2 S7 F P2 S8 … G S1 S9 S89 H S2 S10 S90
Chú thích sơ đồ đĩa:
A1, B1: kí hiệu N: mẫu đối chứng âm.
C1, D1: kí hiệu P1: mẫu đối chứng dương yếu. E1, F1: kí hiệu P2: Mẫu đối chứng dương chuẩn.
Các giếng còn lại G1, H1, A2, B2…: S1, S2….S90: mẫu xét ngiệm. Đánh giá kết quả theo công thức:
PI =100 - ODOD450 test sample
450 max x 100
Trong đó OD450 test sample = giá trị OD của mẫu xét nghiệm. OD450 max = Giá trị OD trung bình của 2 mẫu đối chứng âm.
Mẫu dương tính khi PI ≥ 50%, mẫu âm tính khi PI < 50%
3.5.4. Phương pháp Realtime RT-PCR
3.5.4.1. Phương pháp tách chiết RNA
Chiết tách RNA bằng kit Qiagen Rneasy Extraction
- Cho 600µl dung môi RLT đã bổ sung 1% β-ME vào ống 1,5ml. - Chuyển 200µl mẫu sang ống 1,5ml.
- Lắc đều (Votex) trong 15 giây và ly tâm nhanh (Spindown).
- Cho 400µl cồn Ethanol 100% (cồn tuyệt đối), lắc mạnh bằng Votex trong 15 giây.
- Đặt ống cột lọc (spin column) và hệ thống hút chân không. - Chuyển tất cả dung dịch mẫu sang cột lọc.
- Rửa lần 1: cho 700µl dung môi RW1 vào cột lọc.
- Rửa lần 2: Cho 500µl dung môi RPE vào cột lọc và bật máy hút, cho tiếp 500 µl dung môi RPE vào cột lọc và bật máy hút.
- Đặt cột lọc vào ống thu mới (collection tube). - Ly tâm cột lọc trong 2 phút ở tốc độ 14.000rpm. - Thu RNA: chuyển cột lọc sang ống 1,5ml mới.
- Cho 50µl RNase free H2O vào cột lọc. Ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút. - Ly tâm trong 1 phút ở tốc độ 10.000rpm.
- Chuyển mẫu RNA đã thu sang ống 1,5ml mới.
- Cất giữ RNA ở 40C trong vài giờ nếu sử dụng ngay. Cất giữ ở nhiệt độ - 200C nếu chưa dùng ngay trong ngày.
3.5.4.2. Tiến hành phản ứng
- Trình tự cặp mồi và thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 3.2: Thành phần phản ứng Realtime RT-PCR và bảng 3.3 Bảng 3.2. Thành phần phản ứng Realtime RT-PCR Nguyênliệu Thểtích(µl) H2O 10,5 Dung dịch đệm 5X 5,0 MgCl2 (25 mM) 1,2 dNTP 0,8 Hỗn hợp enzym 1,0 Mồi xuôi (20µM) 0,5 Mồi ngược (20µM) 0,5 Probe (6µM) 0,5 Mẫu ARN 5,0 Tổngcộng 25,0 Bảng 3.3. Trình tự cặp mồi và probe
Mồi và probe Chuỗi (5’– 3’)-FAM
Mồi xuôi AGATGCAGGARGACATGTCAA
Mồi ngược TTGTACCAGGGYTTGGCYT
Probe AAACACGGACCCGACTTTAACCG
Nguồn: Trung tâm Chẩn đoán Thú y TW (2010) - Chu trình nhân gen
Sau khi chuẩn bị xong hỗn hợp phản ứng, tiến hành phản ứng Realtime RT-PCR trên máy PCR đã được cài đặt chương trình được nêu trong bảng 3.4
Bảng 3.4. Chu trình nhiệt phản ứng Realtime RT-PCR
Bước Chu kỳ Thời gian Nhiệt ñộ
Bước phiên mã ngược 1 chu kỳ 15 min 50 0C
2 min 95 0C Bước biến tính 40 chu kỳ 10 s 95 0C Bắt cặp 50 s 60 0C 3.5.4.3 Đọc kết quả
Kết quả dựa trên giá trị Ct, nếu: Mẫu dương tính: Khi 35 ≥ Ct ≥ 20. Mẫu âm tính: Khi không có Ct. Mẫu nghi ngờ: Khi 40 ≥ Ct ≥ 35.
3.5.5. Phương pháp RT-PCR
3.5.5.1. Phương pháp tách chiết RNA
Chiết tách RNA bằng kit Qiagen Rneasy Extraction
- Cho 600µl dung môi RLT đã bổ sung 1% β-ME vào ống 1,5ml. - Chuyển 200µl mẫu sang ống 1,5ml.
- Lắc đều (Votex) trong 15 giây và ly tâm nhanh (Spindown).
- Cho 400µl cồn Ethanol 100% (cồn tuyệt đối), lắc mạnh bằng Votex trong 15 giây.
- Đặt ống cột lọc (spin column) và hệ thống hút chân không. - Chuyển tất cả dung dịch mẫu sang cột lọc.
- Rửa lần 1: cho 700µl dung môi RW1 vào cột lọc.
- Rửa lần 2: Cho 500µl dung môi RPE vào cột lọc và bật máy hút, cho tiếp 500 µl dung môi RPE vào cột lọc và bật máy hút.
- Đặt cột lọc vào ống thu mới (collection tube). - Ly tâm cột lọc trong 2 phút ở tốc độ 14.000rpm. - Thu RNA: chuyển cột lọc sang ống 1,5ml mới.
- Cho 50µl RNase free H2O vào cột lọc. Ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút. - Ly tâm trong 1 phút ở tốc độ 10.000rpm.
- Chuyển mẫu RNA đã thu sang ống 1,5ml mới.
- Cất giữ RNA ở 40C trong vài giờ nếu sử dụng ngay. Cất giữ ở nhiệt độ - 200C nếu chưa dùng ngay trong ngày.
3.5.5.2. Tiến hành phản ứng
- Trình tự cặp mồi và thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 3.5 và bảng 3.6 Bảng 3.5. Thành phần phản ứng RT-PCR Nguyên liệu Thể tích (µl) H2O 12,0 5X Dung dịch ñệm 5,0 dNTP 1,0 Hỗn hợp enzym 1,0 Mồi xuôi 0,5 Mồi ngược 0,5 Mẫu ARN 5,0 Tổng cộng 25,0 Bảng 3.6. Trình tự cặp mồi
TypeVirus Cặpmồi Chiều Chuỗi(5’ –3’)
Kích thước (bp)
FMDV O
P33 Ngược AGC TTG TAC CAG GGT TTG GC
402 P38 Xuôi GCT GCC TAC CTC CTT CAA
FMDV A
P33 Ngược AGC TTG TAC CAG GGT TTG GC 732 P87 Xuôi GTC ATT GAC CTC ATG CAG ACC CAC
FMDV C
P33 Ngược AGC TTG TAC CAG GGT TTG GC 596 P40 Xuôi GTT TCT GCA CTT GAC AAC ACA
FMDV Asia 1
P33 Ngược AGC TTG TAC CAG GGT TTG GC
292 P74 Xuôi GAC ACC ACT CAG GAC CGC CG
Nguồn: Trung tâm Chẩn đoán Thú y TW (2010) Chuyển 20µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:
− Mẫu kiểm chứng dương: cho 5µl mẫu đối chứng dương có kích cỡ sản phẩm đã biết vào ống phản ứng;
− Mẫu kiểm chứng âm: cho 5µl nước vào ống phản ứng;
− Mẫu bệnh phẩm: cho 5µl mẫu RNA bệnh phẩm vào ống phản ứng.
Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (PCR) đã được cài đặt chu trình nhiệt được nêu trong Bảng 3.7
Bảng 3.7. Chu trình nhiệt phản ứng PCR
Bước Chu kỳ Thời gian Nhiệt ñộ
Bước 1 1 chu kỳ 45 min 37 0C
Bước 2 1 chu kỳ 10 min 94 0C
Bước 3 1 chu kỳ 5 min 94 0C
20 chu kỳ
1 min 94 0C
1 min 58 0C
2 min 72 0C
Bước 4 1 chu kỳ 8 min 72 0C
Bước 5 1 chu kỳ ∞ 4 0C
Quy trình nhân gen này áp dụng cho mồi typ O, A, Asia1 của Pirbright, đối với các cặp mồi khác quy trình có thể thay đổi cho phù hợp.
3.5.5.3. Điện di
•Chuẩn bị bản gel
Pha agarose với nồng độ agarose từ 1,5% đến 2% bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (từ 1,5 gram đến 2 gram agarose với 100ml TAE 1X hoặc TBE 1X) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc cho tan.
Sau đó đun dung dịch agarose sôi, để nguội đến khoảng 40oC đến 50oC thì bổ sung 10µl chất nhuộm màu cho 100ml thạch. Lắc nhẹ để chất nhuộm màu tan đều, tránh tạo bọt.
Tiến hành đổ dung dịch agarose vào khay điện di đã được cài lược; không nên đổ bản gel dày quá 0,8cm.
Chuyển bản gel vào bể điện di, đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) (cùng loại với dung dịch agarose đã đun) vào bể điện di cho tới khi ngập bản gel.
•Chạy điện di
Chuyển 2µl Loading dye 6X vào 8µl mỗi loại mẫu (kiểm chứng âm, dương) và sản phẩm PCR ra trộn đều và cho vào các giếng trên bản gel. Đưa gel vào chạy điện di trong bộ điện di với thang chuẩn ADN (marker) để dự đoán