nhiên bằng phương pháp 3ABC - ELISA
Nguyên liệu: Bộ KIT chẩn đoán PrioCHECK® FMDV NS và các dụng cụ thông thường sử dụng trong phòng thí nghiệm.
* Các bước tiến hành xét nghiệm:
- Đĩa ELISA đã có sự gắn kết giữa kháng thể đơn dòng đặc hiệu (mAb) và kháng nguyên 3ABC của virus LMLM.
- Chuẩn bị nguyên liệu:
•Dilution buffer (2X), nồng độ pha loãng 1/2: 2ml Dilution buffer (2X) và 2 ml nước khử khoáng.
•ELISA buffer, nồng độ pha loãng 1/10: 0.4ml ELISA buffer và 3.6ml Dilution buffer đã pha loãng.
•Washing solution (200X), nồng độ pha loãng 1/200: 8ml Washing solution (200X) và 1.6l nước khử khoáng.
Xét nghiệm được tiến hành như sau:
- Bước 1: Cho 80µl đã pha loãng vào tất cả các giếng.
- Bước 2: Cho 20µl đối chứng âm vào 2 giếng A1 và B1; 20 µl đối chứng dương yếu vào 2 giếng C1 và D1; 20µl đối chứng dương vào 2 giếng E1 và F1; 20µl mẫu huyết thanh trâu bò vào các giếng còn lại. Phủ kín và lắc nhẹ đĩa; ủ qua đêm ở nhiệt độ 22±30C.
- Bước 3: Loại bỏ…. sau đó rửa đĩa bằng dung dịch Washing solution đã pha loãng với lượng 300µl/giếng, đập đĩa dứt khoát sau mỗi lần rửa. Lặp lại 6 lần.
- Bước 4: Gắn conjugate, tỷ lệ 1: 30.
+ Pha loãng Conjugate: 55µl Conjugate (30x) + 2.03ml ELISA buffer đã pha loãng.
+ Cho 100µl conjugate/giếng, phủ kín đĩa và ủ ở 22±30C trong 60 phút, sau đó lặp lại bước 3.
- Bước 5: Cho 100µl Chromogen (TMB) substrate/giếng vào tất cả các giếng, ủ ở 22±30C trong 20 phút.
- Bước 6: Dừng phản ứng: Cho 100µl Stop Slution/giếng vào tất cả các giếng.
- Bước 7: Đọc kết quả phản ứng bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 450nm. - Sơ đồ đĩa như sau:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A N S3 … B N S4 C P1 S5 D P1 S6 E P2 S7 F P2 S8 … G S1 S9 S89 H S2 S10 S90
Chú thích sơ đồ đĩa:
A1, B1: kí hiệu N: mẫu đối chứng âm.
C1, D1: kí hiệu P1: mẫu đối chứng dương yếu. E1, F1: kí hiệu P2: Mẫu đối chứng dương chuẩn.
Các giếng còn lại G1, H1, A2, B2…: S1, S2….S90: mẫu xét ngiệm. Đánh giá kết quả theo công thức:
PI =100 - ODOD450 test sample
450 max x 100
Trong đó OD450 test sample = giá trị OD của mẫu xét nghiệm. OD450 max = Giá trị OD trung bình của 2 mẫu đối chứng âm.
Mẫu dương tính khi PI ≥ 50%, mẫu âm tính khi PI < 50%