3.5.5.1. Phương pháp tách chiết RNA
Chiết tách RNA bằng kit Qiagen Rneasy Extraction
- Cho 600µl dung môi RLT đã bổ sung 1% β-ME vào ống 1,5ml. - Chuyển 200µl mẫu sang ống 1,5ml.
- Lắc đều (Votex) trong 15 giây và ly tâm nhanh (Spindown).
- Cho 400µl cồn Ethanol 100% (cồn tuyệt đối), lắc mạnh bằng Votex trong 15 giây.
- Đặt ống cột lọc (spin column) và hệ thống hút chân không. - Chuyển tất cả dung dịch mẫu sang cột lọc.
- Rửa lần 1: cho 700µl dung môi RW1 vào cột lọc.
- Rửa lần 2: Cho 500µl dung môi RPE vào cột lọc và bật máy hút, cho tiếp 500 µl dung môi RPE vào cột lọc và bật máy hút.
- Đặt cột lọc vào ống thu mới (collection tube). - Ly tâm cột lọc trong 2 phút ở tốc độ 14.000rpm. - Thu RNA: chuyển cột lọc sang ống 1,5ml mới.
- Cho 50µl RNase free H2O vào cột lọc. Ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút. - Ly tâm trong 1 phút ở tốc độ 10.000rpm.
- Chuyển mẫu RNA đã thu sang ống 1,5ml mới.
- Cất giữ RNA ở 40C trong vài giờ nếu sử dụng ngay. Cất giữ ở nhiệt độ - 200C nếu chưa dùng ngay trong ngày.
3.5.5.2. Tiến hành phản ứng
- Trình tự cặp mồi và thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 3.5 và bảng 3.6 Bảng 3.5. Thành phần phản ứng RT-PCR Nguyên liệu Thể tích (µl) H2O 12,0 5X Dung dịch ñệm 5,0 dNTP 1,0 Hỗn hợp enzym 1,0 Mồi xuôi 0,5 Mồi ngược 0,5 Mẫu ARN 5,0 Tổng cộng 25,0 Bảng 3.6. Trình tự cặp mồi
TypeVirus Cặpmồi Chiều Chuỗi(5’ –3’)
Kích thước (bp)
FMDV O
P33 Ngược AGC TTG TAC CAG GGT TTG GC
402 P38 Xuôi GCT GCC TAC CTC CTT CAA
FMDV A
P33 Ngược AGC TTG TAC CAG GGT TTG GC 732 P87 Xuôi GTC ATT GAC CTC ATG CAG ACC CAC
FMDV C
P33 Ngược AGC TTG TAC CAG GGT TTG GC 596 P40 Xuôi GTT TCT GCA CTT GAC AAC ACA
FMDV Asia 1
P33 Ngược AGC TTG TAC CAG GGT TTG GC
292 P74 Xuôi GAC ACC ACT CAG GAC CGC CG
Nguồn: Trung tâm Chẩn đoán Thú y TW (2010) Chuyển 20µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:
− Mẫu kiểm chứng dương: cho 5µl mẫu đối chứng dương có kích cỡ sản phẩm đã biết vào ống phản ứng;
− Mẫu kiểm chứng âm: cho 5µl nước vào ống phản ứng;
− Mẫu bệnh phẩm: cho 5µl mẫu RNA bệnh phẩm vào ống phản ứng.
Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (PCR) đã được cài đặt chu trình nhiệt được nêu trong Bảng 3.7
Bảng 3.7. Chu trình nhiệt phản ứng PCR
Bước Chu kỳ Thời gian Nhiệt ñộ
Bước 1 1 chu kỳ 45 min 37 0C
Bước 2 1 chu kỳ 10 min 94 0C
Bước 3 1 chu kỳ 5 min 94 0C
20 chu kỳ
1 min 94 0C
1 min 58 0C
2 min 72 0C
Bước 4 1 chu kỳ 8 min 72 0C
Bước 5 1 chu kỳ ∞ 4 0C
Quy trình nhân gen này áp dụng cho mồi typ O, A, Asia1 của Pirbright, đối với các cặp mồi khác quy trình có thể thay đổi cho phù hợp.
3.5.5.3. Điện di
•Chuẩn bị bản gel
Pha agarose với nồng độ agarose từ 1,5% đến 2% bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (từ 1,5 gram đến 2 gram agarose với 100ml TAE 1X hoặc TBE 1X) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc cho tan.
Sau đó đun dung dịch agarose sôi, để nguội đến khoảng 40oC đến 50oC thì bổ sung 10µl chất nhuộm màu cho 100ml thạch. Lắc nhẹ để chất nhuộm màu tan đều, tránh tạo bọt.
Tiến hành đổ dung dịch agarose vào khay điện di đã được cài lược; không nên đổ bản gel dày quá 0,8cm.
Chuyển bản gel vào bể điện di, đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) (cùng loại với dung dịch agarose đã đun) vào bể điện di cho tới khi ngập bản gel.
•Chạy điện di
Chuyển 2µl Loading dye 6X vào 8µl mỗi loại mẫu (kiểm chứng âm, dương) và sản phẩm PCR ra trộn đều và cho vào các giếng trên bản gel. Đưa gel vào chạy điện di trong bộ điện di với thang chuẩn ADN (marker) để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Chuyển 10µl thang chuẩn ADN (marker)vào một giếng trên bản gel.
Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 30 min.
Bản gel sau khi điện di xong được lấy ra và đọc kết quả trên máy đọc gel (blue light transilluminator)
3.5.5.4. Đọc kết quả
Đặt bản gen lên trên máy đọc gel:
− Mẫu dương tính có hiển thị vạch sản phẩm giống như mẫu kiểm chứng dương và có kích thước sản phẩm tương ứng tùy từng type (với điều kiện mẫu kiểm chứng âm không có vạch sản phẩm xuất hiện);
− Mẫu âm tính giống mẫu kiểm chứng âm và không có vạch sản phẩm xuất hiện;