Phần 3 Nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
3.1. Nội dung nghiên cứu
- Xác định tỷ lệ lưu hành virus cúm A. - Xác định tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5. - Xác định tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5N1.
- Xác định tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5N1 theo tháng.
- Xác định clade của các chủng virus cúm A/H5N1 thu được thông qua giải trình tự gen HA.
- Xác định độc lực của các chủng virus cúm A/H5N1 thu được thông qua xác định trình tự axit amin của chuỗi nối protein HA.
3.2. ÐỊA ÐIỂM NGHIÊN CỨU
- Địa điểm lấy mẫu: Các chợ buôn bán gia cầm sống tại tỉnh Vĩnh Long. - Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương.
3.3. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
- Mẫu dịch swab hầu họng của gà và vịt lấy tại các chợ buôn bán gia cầm ở tỉnh Vĩnh Long: Mẫu được lấy trong 12 tháng của năm 2016. Mỗi tháng lấy 90 mẫu swab hầu họng (30 gà, 60 vịt) tại 3 chợ (thuộc 3 huyện đã xảy ra dịch cúm năm 2015).
- Vật liệu nghiên cứu: + Máy Real time PCR;
+ Đầu type có lọc 30µl, 200µl, 1000 µl; + Máy ly tâm;
+ Máy trộn;
+ Ống bảo quản 15 ml; + Tăm bông;
+ Dung dịch bảo quản;
+ Kít tách chiết ARN: Bộ kít Qiagen Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc # 74106 250 prep;
+ Mastermix: Sử dụng kít Realtime RT-PCR Invitrogen superscriptIII qRT-PCR;
+ PCR superMix (Cat. No. 11306-016, Invitrogen);
+ Primer và probe matrix thiết kế đặc hiệu cho virus cúm A/H5N1.
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Phương pháp phát hiện virus cúm A/H5N1
3.4.1.1.Phương pháp tách chiếtARN
Các mẫu swab trong dung dịch bảo quản được lắc, ly tâm và chiết tách ARNbằng bộ kít Qiagen Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc # 74106 250 prep theo quy trình của nhà sản xuất dưới đây:
- Nhỏ 200l mẫu vào ống ly tâm loại 1,5ml cùng với 600l Qiagen buffer RLT có 1% -ME, lắc đều bằng máy trộn (vortex) rồi ly tâm nhẹ.
- Thêm 500 l etanol 70% vào ống, lắc đều bằng máy trộn rồi ly tâm nhẹ. - Chuyển tất cả dịch nổi sang cột lọc RNeasy Qiagen, ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 15 giây ở nhiệt độ phòng.
- Bổ sung 700 l dung dịch rửa RW1 vào cột RNeasy Qiagen, ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 15 giây, thay ống thu mới vào cột lọc.
- Nhỏ 500l dung dịch rửa RPE buffer vào cột RNeasy và ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 15 giây, thay ống thu mới, lặp lại 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer.
- Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc và ống thu ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ ống thu.
- Đặt cột lọc vào ống thu ARN, nhỏ 50 l nước sạch nuclease vào cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ cột lọc, giữ lại dung dịch trong ống thu ARN.
- Bảo quản mẫu ARN thu được ở 4 oC trong thời gian ngắn trước khi làm RT-PCR. Nếu làm phản ứng sau 24 giờ, nên bảo quản mẫu ở âm 20 oC hoặc nhiệt độ thấp hơn.
3.4.1.2.Phương pháp Realtime RT-PCR (rRT-PCR) xác định virus cúm A/H5N1
Thực hiện phản ứng Realtime RT-PCR (rRT-PCR) sử dụng các cặp mồi và probe (Bảng 3.1) được thiết kế đặc hiệu cho virus cúm A/H5N1 (theo quy trình chẩn đoán – TCVN 8400-26:2014).
Bảng 3.1. Các primer và probe để phát hiện virus cúm gia cầm A/H5N1
Primer/probe Trình tự chuỗi nucleotide (5’-3’) Đầu
5’ 3’
M
Probe TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG FAM BHQ1 Xuôi GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA
Ngược AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA H5
Probe TCA ACA GTG GCG AGT TCC CTA GCA FAM BHQ1 Xuôi ACA TAT GAC TAC CCA CAR TAT TCA G
Ngược AGA CCA GCT AYC ATG ATT GC N1
Probe TGG TCT TGG CCA GAC GGT GC FAM BHQ1
Xuôi TGG ACT AGT GGG AGC AGC AT Ngược TGT CAA TGG TTA AGG GCA ACT C
Trong đó:
Nucleotide R = nucleotide A hoặc G Nucleotide Y = nucleotide C hoặc T Nucleotide K = nucleotide G hoặc T Nucleotide N = nucleotide bất kì + Các primer M để xác định virus cúm A.
+ Các primer H5 để xác định gen H5. + Các primer N1 để xác định gen N1.
- Thành phần của phản ứng được trình bày ở bảng 3.2:
Bảng 3.2. Thành phần của phản ứng Realtime RT-PCR Hỗn hợp phản ứng Lượng dùng cho 1 phản ứng (µl) Hỗn hợp phản ứng Lượng dùng cho 1 phản ứng (µl) 2x Reaction buffer 12,5 Mồi xuôi 20 μM 0,5 Mồi ngược 20 μM 0,5 Taqman probe 6 μM 0,5 Enzyme mix 0,5 Nước cất sạch nuclease 5,5 Mẫu ARN 5,0
- Chu trình nhiệt của phản ứng: + 1 vòng ở 50 oC trong 15 phút. + 1 vòng ở 95 oC trong 2 phút.
3.4.2. Phương pháp giải trình tự gen
3.4.2.1.Phương pháp nhân gen HA - Chiết táchARN (xem 2.4.1.1).
- Nhân đoạn gen HA bằng phản ứng RT-PCR (PCR phiên mã ngược) với các cặp primer đặc hiệu (Bảng 3.3) (Hoffmann et al., 2001).
Bảng 3.3. Trình tự primer để nhân gen HA
Tên primer Trình tự chuỗi nucleotide (5’-3’)
Cặp 1
S17_H5-F1 TGT AAA ACG ACG GCC AGT AGC AAA AGC AGG GGT YTA AT
S18_H5- 1111R
CAG GAA ACA GCT ATG ACC CAT ACC AAC CAT CTA YCA TTC C
Cặp 2
S19_H5-F751 TGT AAA ACG ACG GCC AGT AYG CMT AYA ARA TTG TCA AG
S20_H5- R1773
CAG GAA ACA GCT ATG ACA GTA GAA ACA AGG GTG TTT TTA ACT ACA AT
- Pha master mix để chạy phản ứng PCR: Sử dụng kít PCR superMix (Cat. No. 11306-016, Invitrogen) và các thành phần phản ứng khác (Bảng 3.4).
- Chu trình nhiệt:
+ 1 vòng ở 50 °C trong 20 phút. + 1 vòng ở 95 °C trong 2 phút.
+ 1 vòng: 95 °C trong 10 giây + 61 °C trong 30 giây + 68 °C trong 1 phút. + 1 vòng: 95 °C trong 10 giây + 59 °C trong 30 giây + 68 °C trong 1 phút. + 1 vòng: 95 °C trong 10 giây + 57 °C trong 30 giây + 68 °C trong 1 phút. + Chu trình 35 vòng: 95 °C trong 10 giây + 55 °C trong 30 giây + 68 °C trong 1 phút. + 1 vòng ở 25 °C trong 1 phút. Bảng 3.4. Thành phần của phản ứng RT-PCR Hỗn hợp phản ứng Lượng dùng cho 1 phản ứng (µl) PCR superMix 12,5 Mồi xuôi (20 μM) 0,5 Mồi ngược (20 μM) 0,5 MgSO4 50 (μM) 0,5 Enzym 1,0 Nước cất sạch nuclease 8,5 Mẫu ARN 2,0
3.4.2.2.Phương pháp xây dựng cây phả hệ
- Sử dụng phần mềm Bioedit 7 để thực hiện việc so sánh các chuỗi trình tự (Alignment).
- Dựng cây phả hệ cho virus cúm(chuỗi gen HA) bằng phần mềmMEGA 7 (Molecular Evolutionary Genetic Analysis) sử dụng phương pháp Neighbor- joining (NJ). Dựng cây phả hệ so sánh với các virus cúm A/H5N1 thuộc các clade (nhánh) khác nhau với gốc là virus clade 0 (A/goose/Guangdong/1/96). 3.4.2.3.Phương pháp phân tích và sử lý số liệu
PHẦN 4.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. TÌNH HÌNH CHĂN NUÔI VÀ TIÊM PHÒNG VACXIN CHO GIA
CẦM TẠI TỈNH VĨNH LONG
Từ năm 2014 đến 2016, tổng đàn gà tại tỉnh Vĩnh Long liên tục tăng (Bảng 4.1). Số lượng gà nuôi trong toàn tỉnh năm 2015 là 4.580.700 con, tăng 590.560 con so với năm 2014 (3.990.140 con gà). Năm 2016, theo số liệu của Chi cục Thú y tỉnh Vĩnh Long, số lượng gà nuôi toàn tỉnh là 4.826.630 con, tăng 245.930 con so với năm 2015.
Bảng 4.1. Tình hình chăn nuôi và tiêm phòng vacxin cho gia cầm tại tỉnh Vĩnh Long tại tỉnh Vĩnh Long
Năm Loài Số lượng (con) Số liều vacxin
2014 Gà 3.990.140 3.091.479 Vịt* 2.715.590 3.350.983 Tổng 6.705.730 6.442.462 2015 Gà 4.580.700 3.860.857 Vịt* 2.716.560 4.626.226 Tổng 7.297.260 8.487.083 2016 Gà 4.826.630 1.684.910 Vịt* 2.846.200 3.096.461 Tổng 7.672.830 4.781.371 * Đàn vịt không kể đàn vịt chạy đồng
Nguồn: Báo cáo hàng năm của Chi cục Thú y tỉnh Vĩnh Long năm 2016.
Về đàn vịt (không bao gồm đàn vịt chạy đồng) có sự biến động ít hơn.Năm 2014 và 2015, tổng đàn vịt lần lượt là 2.715.590 con, 2.716.560 con. Riêng năm 2016, số lượng vịt tăng 129.640 con so với năm 2015.
Để phòng chống bệnh cúm gia cầm, hàng năm Chi cục Thú y tỉnh Vĩnh Long tổ chức hai đợt tiêm vacxin phòng bệnh cho đàn gà, vịt. Đợt 1 từ tháng 6 và đợt 2 từ tháng 7 đến tháng 12. Ngoài ra, các tháng còn lại, tiêm bổ sung cho đàn gia cầm chưa đến tuổi tiêm phòng hoặc đàn còn bỏ sót trong đợt tiêm chính, đàn hết thời gian miễn dịch bảo hộ và đàn nuôi mới.Loại vacxin đang được sử dụng là vacxinNavet-Vifluvac (Công ty Navetco).Kết quả tiêm phòng vacxin được trình bày ở bảng 4.1.
Số liệu ở bảng 4.1 cho thấy: Năm 2014, tổng số liều vacxin được sử dụng là 6.442.462 liều. Trong đó, gà là 3.091.479 liều, vịt là 3.350.983 liều.
Năm 2015, tổng số liều vacxin được sử dụng là 8.487.083 liều trong đó cho gà là 3.860.857 liều, cho vịt là 4.626.226 liều.
Năm 2016, tổng số liều vacxin được sử dụng là 4.781.371 liều trong đó cho gà là 1.684.910 liều, cho vịt là3.096.461 liều.
4.2.TÌNH HÌNH DỊCH CÚM GIA CẦM TẠI TỈNH VĨNH LONG
Bệnh cúm gia cầm xuất hiện ở Việt Nam từ cuối năm 2003, xảy ra trên phạm vi nhiều tỉnh trong cả nước gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng. Những năm gần đây, bệnh dần trở thành dịch địa phương với đặc điểm các ổ dịch phát sinh rải rác, lẻ tẻ. Các ổ dịch đều phát ra trên đàn gia cầm của hộ gia đình, chủ yếu là vịt được nuôi phân tán, nhỏ lẻ và không có hiện tượng lây lan rộng (Cục Thú y, 2016).
Hình 4.1. Bản đồ tỉnh Vĩnh Long
Vĩnh Long là một tỉnh ở miền Nam gồm 8 huyện (thị xã, thành phố) là thị xã Bình Minh, Tam Bình, Bình Tân, Long Hồ, Mang Thít, Trà Ôn, Vũng Liêm, thành phố Vĩnh Long (Hình 4.1).Năm 2014 và 2015, tại Vĩnh Long xảy ra 20 ổ dịch nhỏ trên cả gà và vịt tại 7/8 huyện (thành phố Vĩnh Long không xuất hiện ổ dịch cúm). Tuy nhiên, tỉnh Vĩnh Long đã khống chế tốt các ổ dịch, không để lây lan rộng và không lây bệnh cho người, giảm mức độ thiệt hại cho ngành chăn nuôi gia cầm, tạo điều kiện cho phát triển chăn nuôi gia cầm. Tình hình dịch cúm gia cầm tại tỉnh Vĩnh Long năm 2014 và 2015 được trình bày ở mục 4.2.1 và mục 4.2.2.
4.2.1. Tình hình dịch cúm gia cầm tại tỉnh Vĩnh Long năm 2014
Năm 2014, theo thống kê của Chi cụcThú y tỉnh Vĩnh Long (Bảng 4.2), toàn tỉnh có 12 ổ dịch xuất hiện trên địa bàn của 6 huyện (thị xã, thành phố) với tổng số gia cầm mắc bệnh là 29.869 con. Cụ thể là:
Bảng 4.2. Tình hình dịch cúm gia cầm tại tỉnh Vĩnh Long năm 2014
-Thị xã Bình Minh xảy ra 3 ổ dịch cúm gia cầm trên vịt tại các xã Thành Phước, Đông Thành, Xã Thuận với số lượng gia cầm mắc bệnh là 8.665 con.
- Huyện Vũng Liêm xảy ra 4 ổ dịch trên vịt tại 4 xã là Trung Ngãi, Hiếu Thành, Trung Chánh và Trung An với số vịt mắc bệnh là 6.630 con.
- Huyện Trà Ôn có 1 ổ dịch trên gà tại xã Tân Mỹ với số lượng gà mắc bệnh là 1.200 con.
- Huyện Mang Thít có 2 ổ dịch trên gà và vịt tại 2 xã Hòa Tịnh và Bình Phước với số gia cầm mắc bệnh là 1.892 con.
- Huyện Bình Tân có 1 ổ dịch trên vịt tại xã Mỹ Thuận với số vịt mắc bệnh là 4.200 con.
Thời gian xảy ra các ổ dịch là từ tháng 1 đến tháng 4 năm 2014.
4.2.2. Tình hình dịch cúm gia cầm tại tỉnh Vĩnh Long năm 2015
Tình hình dịch dịch cúm gia cầm tại tỉnh Vĩnh Long năm 2015 được trình bày ở bảng 4.3. TT Huyện, Thị xã, Thành Phố Loài vật nuôi Thời gian xảy ra dịch bệnh Số gia cầm mắc bệnh (con) Xã xảy ra dịch cúm gia cầm 1 TX Bình Minh Vịt 17/1/2014 215 Thành Phước 02/3/2014 3.450 Đông Thành 02/3/2014 5.000 Xã Thuận 2 Vũng Liêm Vịt 03/2/2014 800 Trung ngãi 08/2/2014 4.125 Hiếu Thành 20/2/2014 700 Trung Chánh 02/4/2014 1.005 Trung An 3 Tam Bình Vịt 15/2/2014 6.282 Mỹ Lộc 4 Trà Ôn Gà 18/2/2014 1.200 Tân Mỹ 5 Mang Thít Gà, Vịt 11/3/2014 1.700 Hòa Tịnh 12/3/2014 1.192 Bình Phước 6 Bình Tân Vịt 14/3/2014 4.200 Mỹ Thuận Tổng cộng 29.869
Bảng 4.3. Tình hình dịch cúm gia cầm tại tỉnh Vĩnh Long năm 2015 TT Huyện, Thị xã, TT Huyện, Thị xã,
Thành Phố
Loài vật nuôi
Thời gian xảy ra dịch bệnh Số gia cầm mắc bệnh Xã xảy ra dịch bệnh 1 Mang Thít Vịt 06/3/2015 1.600 Long Mỹ 2 Tam Bình Gà 11/5/2015 300 Hòa Lộc 24/8/2015 1.550 Mỹ Lộc 3 TX Bình Minh Gà 03/7/2015 275 Thuận An 08/8/2015 164 Mỹ Hòa 4 Long Hồ Gà 18/7/2015 1.265 Phú Quới 5 Vũng Liêm Gà 15/8/2015 1.048 Trung Thành 6 Bình Tân Vịt 06/9/2015 6.857 Mỹ Thuận Tổng 13.059
Số liệu tại bảng 4.3 cho thấy: Năm 2015, tình hình dịch cúm gia cầm tại tỉnh Vĩnh Long có giảm hơn so với năm 2014. Toàn tỉnh có 8 ổ dịch xảy ra tại 6 huyện (thị xã) với tổng số gia cầm mắc bệnh là 13.059 con, giảm so với năm 2015 (với số gia cầm mắc bệnh là 16.810 con). Cụ thể là:
- Huyện Mang Thít có 1 ổ dịch trên vịt tại xã Long Mỹ với số gia cầm mắc bệnh là 1.600 con.
- Huyện Tam Bình có 2 ổ dịch trên gà tại 2 xã Hòa Lộc và Mỹ Lộc với số gà mắc bệnh là 1.850 con.
- Thị xã Bình Minh có 2 ổ dịch trên gà tại 2 xã Thuận An và Mỹ Hòa với số gia cầm mắc bệnh là 1.892 con.
- Huyện Long Hồ có 1 ổ dịch trên gà tại xã Phú Quới với số gà mắc bệnh là 1.265 con.
- Huyện Vũng Liêm có 1 ổ dịch trên gà tại xã Trung Thành với số gà mắc bệnh là 1.048 con.
- Huyện Bình Tân có 1 ổ dịch trên vịt tại xã Mỹ Thuận với số gà mắc bệnh là 6.857 con.
Bệnh xảy ra lẻ tẻ từ tháng 3 đến tháng 9 năm 2015.
4.3. XÁC ĐỊNHVIRUS CÚM TYPE A
Các nghiên cứu cho thấy gia cầm và đặc biệt là thủy cầm mặc dù mang mầm bệnh nhưng không biểu hiện các triệu chứng lâm sàng và thường xuyên bài thải mầm bệnh ra môi trường gây cảm nhiễm cho các động vật cảm thụ khác. Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành lấy mẫu dịch hầu họng của gia cầm gồm gà và vịt. Mẫu được lấy tại 3 chợ tại tỉnh Vĩnh Long là chợ Cái Ngang
(huyện Tam Bình), chợ Cái Nhum (huyện Mang Thít) và chợ Thị trấn Long Hồ (huyện Long Hồ). Đây là các chợ thuộc các huyện đã xảy ra dịch cúm gia cầm H5N1 năm 2015. Các mẫu được xét nghiệm sàng lọc virus cúm type A theo phương pháp rRT-PCR theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN8400-26:2014. Kết quả được trình bày ở bảng 4.4 và hình 4.2.
Bảng 4.4. Kết quả xét nghiệm virus cúm type A Tên chợ Tên chợ (Huyện) Số mẫu xét nghiệm Số mẫu dương tính virus cúm A Tỷ lệ (%) mẫu dương tính virus cúm A
Chợ Cái ngang (Tam Bình) 360 54 15,00
Chợ Cái Nhum (Mang Thít) 360 51 14,17
Chợ TT Long Hồ (Long Hồ) 360 71 19,72
Tổng cộng 1080 176 16,30
Kết quả ở bảng 4.4 cho thấy: Mặc dù gà, vịt buôn bán tại các chợ gia cầm sống là các gia cầm khỏe mạnh không có biểu hiện lâm sàng của bệnh cúm gia cầm nhưng vẫn mang virus cúm A. Trong tổng số 1080 mẫu được xét nghiệm sàng lọc virus cúm A có 176 mẫu dương tính, chiếm tỷ lệ 16,30%. Trong đó cao nhất là tại chợ Thị trấn Long Hồ với 19,72%, tiếp theo là chợ Cái Ngang, 15,00%, thấp nhất là chợ Cái Nhum (14,17%). Kết quả này thấp hơn so với kết quả giám sát tại 14 tỉnh của Cục Thú y các năm từ 2011 đến 2013 với tỷ lệ gia cầm dương tính với virus cúm A là 22,1% (tổng số 2162/9790 mẫu dương tính) (Nguyen et al., 2014). Nguyên nhân có thể là do đợt giám sát trên là xét nghiệm dựa trên mẫu gộp (5 mẫu gộp thành 1 mẫu xét nghiệm) do đó 1 mẫu trong 1 mẫu dương tính có thể cho kết quả dương tính. Đồng thời trong các giai đoạn nghiên cứu trên bệnh cúm gia cầm vẫn xảy ra rải rác trong cả nước, trong khi đó trong năm 2016, Vĩnh Long không xảy ra bùng phát ổ dịch cúm gia cầm (Cục Thú y, 2016).
Hình 4.2. Tỷ lệ nhiễm virus cúm A