Phương pháp nghiên cứu

Phần 3 Nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

3.4.Phương pháp nghiên cứu

3.4.1. Phương pháp phát hiện virus cúm A/H5N1

3.4.1.1.Phương pháp tách chiếtARN

Các mẫu swab trong dung dịch bảo quản được lắc, ly tâm và chiết tách ARNbằng bộ kít Qiagen Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc # 74106 250 prep theo quy trình của nhà sản xuất dưới đây:

- Nhỏ 200l mẫu vào ống ly tâm loại 1,5ml cùng với 600l Qiagen buffer RLT có 1% -ME, lắc đều bằng máy trộn (vortex) rồi ly tâm nhẹ.

- Thêm 500 l etanol 70% vào ống, lắc đều bằng máy trộn rồi ly tâm nhẹ. - Chuyển tất cả dịch nổi sang cột lọc RNeasy Qiagen, ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 15 giây ở nhiệt độ phòng.

- Bổ sung 700 l dung dịch rửa RW1 vào cột RNeasy Qiagen, ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 15 giây, thay ống thu mới vào cột lọc.

- Nhỏ 500l dung dịch rửa RPE buffer vào cột RNeasy và ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 15 giây, thay ống thu mới, lặp lại 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer.

- Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc và ống thu ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ ống thu.

- Đặt cột lọc vào ống thu ARN, nhỏ 50 l nước sạch nuclease vào cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ cột lọc, giữ lại dung dịch trong ống thu ARN.

- Bảo quản mẫu ARN thu được ở 4 oC trong thời gian ngắn trước khi làm RT-PCR. Nếu làm phản ứng sau 24 giờ, nên bảo quản mẫu ở âm 20 oC hoặc nhiệt độ thấp hơn.

3.4.1.2.Phương pháp Realtime RT-PCR (rRT-PCR) xác định virus cúm A/H5N1

Thực hiện phản ứng Realtime RT-PCR (rRT-PCR) sử dụng các cặp mồi và probe (Bảng 3.1) được thiết kế đặc hiệu cho virus cúm A/H5N1 (theo quy trình chẩn đoán – TCVN 8400-26:2014).

Bảng 3.1. Các primer và probe để phát hiện virus cúm gia cầm A/H5N1

Primer/probe Trình tự chuỗi nucleotide (5’-3’) Đầu

5’ 3’

M

Probe TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG FAM BHQ1 Xuôi GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA

Ngược AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA H5

Probe TCA ACA GTG GCG AGT TCC CTA GCA FAM BHQ1 Xuôi ACA TAT GAC TAC CCA CAR TAT TCA G

Ngược AGA CCA GCT AYC ATG ATT GC N1

Probe TGG TCT TGG CCA GAC GGT GC FAM BHQ1

Xuôi TGG ACT AGT GGG AGC AGC AT Ngược TGT CAA TGG TTA AGG GCA ACT C

Trong đó:

Nucleotide R = nucleotide A hoặc G Nucleotide Y = nucleotide C hoặc T Nucleotide K = nucleotide G hoặc T Nucleotide N = nucleotide bất kì + Các primer M để xác định virus cúm A.

+ Các primer H5 để xác định gen H5. + Các primer N1 để xác định gen N1.

- Thành phần của phản ứng được trình bày ở bảng 3.2:

Bảng 3.2. Thành phần của phản ứng Realtime RT-PCR Hỗn hợp phản ứng Lượng dùng cho 1 phản ứng (µl) Hỗn hợp phản ứng Lượng dùng cho 1 phản ứng (µl) 2x Reaction buffer 12,5 Mồi xuôi 20 μM 0,5 Mồi ngược 20 μM 0,5 Taqman probe 6 μM 0,5 Enzyme mix 0,5 Nước cất sạch nuclease 5,5 Mẫu ARN 5,0

- Chu trình nhiệt của phản ứng: + 1 vòng ở 50 oC trong 15 phút. + 1 vòng ở 95 oC trong 2 phút.

3.4.2. Phương pháp giải trình tự gen

3.4.2.1.Phương pháp nhân gen HA - Chiết táchARN (xem 2.4.1.1).

- Nhân đoạn gen HA bằng phản ứng RT-PCR (PCR phiên mã ngược) với các cặp primer đặc hiệu (Bảng 3.3) (Hoffmann et al., 2001).

Bảng 3.3. Trình tự primer để nhân gen HA

Tên primer Trình tự chuỗi nucleotide (5’-3’)

Cặp 1

S17_H5-F1 TGT AAA ACG ACG GCC AGT AGC AAA AGC AGG GGT YTA AT

S18_H5- 1111R

CAG GAA ACA GCT ATG ACC CAT ACC AAC CAT CTA YCA TTC C

Cặp 2

S19_H5-F751 TGT AAA ACG ACG GCC AGT AYG CMT AYA ARA TTG TCA AG

S20_H5- R1773

CAG GAA ACA GCT ATG ACA GTA GAA ACA AGG GTG TTT TTA ACT ACA AT

- Pha master mix để chạy phản ứng PCR: Sử dụng kít PCR superMix (Cat. No. 11306-016, Invitrogen) và các thành phần phản ứng khác (Bảng 3.4).

- Chu trình nhiệt:

+ 1 vòng ở 50 °C trong 20 phút. + 1 vòng ở 95 °C trong 2 phút.

+ 1 vòng: 95 °C trong 10 giây + 61 °C trong 30 giây + 68 °C trong 1 phút. + 1 vòng: 95 °C trong 10 giây + 59 °C trong 30 giây + 68 °C trong 1 phút. + 1 vòng: 95 °C trong 10 giây + 57 °C trong 30 giây + 68 °C trong 1 phút. + Chu trình 35 vòng: 95 °C trong 10 giây + 55 °C trong 30 giây + 68 °C trong 1 phút. + 1 vòng ở 25 °C trong 1 phút. Bảng 3.4. Thành phần của phản ứng RT-PCR Hỗn hợp phản ứng Lượng dùng cho 1 phản ứng (µl) PCR superMix 12,5 Mồi xuôi (20 μM) 0,5 Mồi ngược (20 μM) 0,5 MgSO4 50 (μM) 0,5 Enzym 1,0 Nước cất sạch nuclease 8,5 Mẫu ARN 2,0

3.4.2.2.Phương pháp xây dựng cây phả hệ

- Sử dụng phần mềm Bioedit 7 để thực hiện việc so sánh các chuỗi trình tự (Alignment).

- Dựng cây phả hệ cho virus cúm(chuỗi gen HA) bằng phần mềmMEGA 7 (Molecular Evolutionary Genetic Analysis) sử dụng phương pháp Neighbor- joining (NJ). Dựng cây phả hệ so sánh với các virus cúm A/H5N1 thuộc các clade (nhánh) khác nhau với gốc là virus clade 0 (A/goose/Guangdong/1/96). 3.4.2.3.Phương pháp phân tích và sử lý số liệu